Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena

Resumen

Fuente: Blair, J. D., et al. Establecimiento de líneas de células madre pluripotentes humanas editadas con genoma: de la selección al aislamiento. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra una técnica de edición del genoma basada en nucleasas de dedos de zinc en células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Dado que las hPSC pueden diferenciarse potencialmente en varios tipos de células, esta tecnología es útil para estudios patológicos y farmacológicos in vitro de manera específica para cada paciente.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparar las células madre para la edición

1. Cultive y cultive células madre pluripotentes humanas (hPSC) en una placa de 6 pocillos que contiene 2,4 × 10⁶ células/placa de alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivados con mitomicina C cultivados en gelatina. Mantener las hPSC en 3 ml de medios de células madre embrionarias humanas por pocillo (medios hESC) y crecer en una incubadora a 37 °C con 3% O

Resultados

Figura 1. Esquema del locus AAVS1 editado genéticamente utilizando la plantilla de reparación AAV-CAGGS-EGFP. Modificado de Hockemeyer et al., 2009.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Tecnologías de la Vida	11320082
Suero fetal bovino (IH)	Tecnologías de la Vida	10082-147
Suero Knockout	Tecnologías de la Vida	10828-028
Factor de crecimiento de fibroblastos - básico	Tecnologías de la Vida	PHG0261
Pluma/Estreptococo	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122
glutamina	Tecnologías de la Vida	25030-081
MEM NEAA	Tecnologías de la Vida	11140-050
2-mercaptoetanol	Tecnologías de la Vida	21985-023
Y-27632	Calbiochem	688000
Placas de 6 pocillos	Corning	3506
Cubetas de electroporación de 4 mm	Bio-rad	165-2081
Pulsador de genes X-cel II	Bio-rad	Teléfono: 165-2661
0,25% Tripsina-EDTA	Tecnologías de la Vida	25200-056
10× Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH7.4	Tecnologías de la Vida	70011-044
Puromicina	Tecnologías de la Vida	A11138-02