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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparar las células madre para la edición
- Cultive y cultive células madre pluripotentes humanas (hPSC) en una placa de 6 pocillos que contiene 2,4 × 106 células/placa de alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivados con mitomicina C cultivados en gelatina. Mantener las hPSC en 3 ml de medios de células madre embrionarias humanas por pocillo (medios hESC) y crecer en una incubadora a 37 °C con 3% O2/5% CO2.
nota: Para el éxito de este protocolo, no es necesario mantener las hPSC en una incubadora de bajo oxígeno; sin embargo, es importante tener en cuenta que las hPSC proliferan más rápido en un entorno con alto nivel deO2, por lo que los tiempos y el número de células deben ajustarse en consecuencia. También debe tenerse en cuenta que las hPSC mantenidas en bajo nivel de oxígeno tienen tasas más bajas de diferenciación espontánea.
- Para hacer 500 ml de medios hESC, combine 380 ml de DMEM/F12, 75 ml de suero fetal bovino (FBS), 25 ml de suero de reemplazo KnockOut (KSR). Añadir Glutamina (concentración final de 1 mM), 5 ml de 100x Aminoácidos No Esenciales, 100 unidades/ml de Penicilina-Estreptomicina (P/S), Factor de Crecimiento de Fibroblastos básico (bFGF) (concentración final de 4 ng/ml) y 2-mercaptoetanol (concentración final de 5,5 μM).
- Cambie el medio eliminando todo el volumen del medio (3 ml) con una pipeta de vidrio y aspire. Reemplácelo con 3 ml de medios hESC tibios con una pipeta serológica. Repita el cambio de medios todos los días hasta que las hPSC sean aproximadamente un 50% confluentes (día-1).
- Un día antes de la segmentación (día 1), cambie el medio hESC, quitando el medio antiguo y añadiendo el medio hESC tibio complementado con 10 μM Y-27632.
- También en el día -1, prepare una o dos placas de 6 pocillos o 10 cm de celdas alimentadoras de MEF resistentes a medicamentos de ratones DR4 (2,4 × 106 células/placa).
Nota: En general, las placas de 6 pocillos son ventajosas sobre las placas de 10 cm, ya que acomodan más medios. Las placas de 6 pocillos también aseguran que los diferentes clones de diferentes pocillos sean independientes. Sin embargo, una placa de 10 cm permitirá una recolección más fácil, dependiendo del microscopio disponible para este proceso.
>2. Edición de Células Madre Pluripotentes
- Prepare las soluciones de transfección pipeteando 5 μg de ZFN 1 y 2 (Figura 1) en un tubo de 1,5 ml. Pipetee 30 μg del plásmido de reparación en este tubo también. Por último, pipetee 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el tubo para aumentar el volumen hasta 300 μl.
nota: Prepare plásmidos como midiprep (cualquier kit es adecuado) con una concentración mínima de 300 ng/μl para mantener el volumen total de la solución de transfección por debajo de 300 μl. No es necesario realizar una extracción de fenol/cloroformo, linealizar el plásmido o utilizar un kit de preparación de plásmidos sin endotoxinas.
- Retire los medios de las hPSC con una pipeta de vidrio y aspire. Pipetear 2 ml de PBS tibio en cada pocillo para lavar las células.
- Retire el PBS inmediatamente con una pipeta de vidrio y aspire. Añadir 0,5 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25% directamente sobre las células de cada pocillo. Coloque en la incubadora (37 °C/5% CO2/3% O2) durante aproximadamente 10 min. o hasta que la capa de alimentación comience a levantarse de la placa.
- Añada 2 ml de medios esWash tibios (470 ml DMEM/F12, 25 ml FBS, 100 unidades/ml P/S) a cada pocillo para detener la reacción de tripsina.
- Asegúrese de que las celdas del alimentador se desprendan como una lámina. Pipetear el contenido de cada pocillo en un solo tubo cónico de 50 ml, combinando todos los pocillos. Triturar las células con una pipeta serológica de 10 ml. No es necesario romper la capa de alimentación; Las hPSC se desprenderán de la capa de alimentación mediante una trituración suave. Debe haber unos 15 ml de la suspensión celular.
- Añada 25 ml de medios esWash al tubo para aumentar el volumen hasta 40 ml en total. Deje que los trozos grandes del alimentador se asienten en el fondo del tubo durante 1-2 minutos. Retirar el sobrenadante (~38 ml) del tubo con una pipeta serológica y depositarlo en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
- Girar durante 5 min a 190 x g. Retirar el sobrenadante del tubo con una pipeta de vidrio y aspirar. Asegúrese de no perturbar la pellet de la celda. Vuelva a suspender las células en 500 μl 1x PBS. Combínelo con la solución de transfección de plásmidos preparada anteriormente. Cuente las celdas en este paso. Utilice de 5 a 10 millones de células por electroporación.
- Pipetear toda la suspensión de 800 μl en una cubeta de electroporación de 4 mm, colocar en hielo durante 3-5 min. Electroporar celdas utilizando el programa exponencial en el sistema de electroporación con los siguientes parámetros: 250 V, 500 μF, resistencia ∞ y tamaño de cubeta de 4 mm. Después de la electroporación, vuelva a colocar la cubeta en hielo durante 3 min.
nota: Observe la constante de tiempo de la electroporación en el sistema de electroporación. La constante de tiempo varía con el número de células y la pureza del ADN. Las transfecciones exitosas generalmente tienen una constante de tiempo entre 10 y 14 mseg cuando se usan las condiciones enumeradas y un pulsador de genes II. Pueden producirse eficiencias de electroporación más bajas cuando las constantes de tiempo varían de estos valores.
- Resuspenda las células electroporadas en 18 ml de medios hESC tibios suplementados con 10 μM de Y-27632. Coloque 3 ml de esta suspensión de una sola célula en cada pocillo de una placa de 6 pocillos con celdas alimentadoras DR4. Retorno a la incubadora (37 °C/5% CO2/3% O2).
>3. Selección de colonias positivas
- Día 2, retire todos los medios con una pipeta de vidrio y aspire. Reemplácelo con 3 ml de medio hESC tibio suplementado con 10 μM Y-27632. Día 3, retire todos los medios con una pipeta de vidrio y aspire. Reemplácelo con 3 ml de medio hESC tibio sin incluir Y-27632. Día 4, retire todos los medios con una pipeta de vidrio y aspire. Reemplácelo con 3 ml de medios de células madre embrionarias calientes suplementados con antibióticos para la selección. Retorno a la incubadora (37 °C/5% CO2/3% O2).
nota: El tipo de antibiótico utilizado dependerá del casete de resistencia incluido en la plantilla de reparación. Cuando se trabaja con hPSC WIBR#3 (registro NIH 0079), se han utilizado con éxito 0,5 μg/ml de puromicina, 70 μg/ml de G418 (genética) y 35 μg/ml de higromicina. Las concentraciones para la selección deben determinarse empíricamente estableciendo la concentración mínima de antibiótico necesaria para matar las células de tipo salvaje en aproximadamente una semana.
- Días 5-12, cambie los medios diariamente, reemplazando los medios viejos cada vez con medios de ESC calientes suplementados con antibióticos.
nota: Espere una gran cantidad de muerte celular. Las colonias individuales se harán evidentes alrededor del día 8-10. Se pueden utilizar medios de hESC regulares sin antibióticos después de 12-14 días de selección continua. Si la densidad celular es alta o la muerte celular es lenta, se debe evitar la acidificación del medio y puede ser necesario aumentar el volumen del medio (hasta 4-5 ml) durante los primeros días de selección.
