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>1. Preparación de la matriz de la membrana basal y recubrimiento de los objetos de plástico
- Coloque el stock de matriz de membrana basal congelado a -20 °C sobre hielo y descongele durante la noche a 4 °C.
- Después de la descongelación, pipetear 2 mg de alícuotas de la matriz de la membrana basal en tubos Eppendorf preenfriados. Guárdelos a -20 °C hasta que los necesite.
- Para preparar placas recubiertas de matriz de membrana basal, descongele una alícuota en hielo hasta que desaparezca el último trozo de hielo en el tubo de Eppendorf (generalmente dentro de ~ 2 horas).
- Después de la descongelación, agregue la matriz de la membrana basal a 12 ml de DMEM/F12 frío (4 °C) para hacer la solución de recubrimiento de la matriz de la membrana basal.
- Agregue la solución de matriz de membrana basal al recipiente de cultivo apropiado. Para una placa de 6 pocillos, dispense 1 ml por pocillo. Gire la placa para asegurarse de que la solución de matriz de membrana basal cubra completamente cada pocillo.
- Parafilm sella la placa/placa recubierta de matriz de membrana basal e incuba a temperatura ambiente durante 1 hora antes de usar. Alternativamente, almacene las placas/platos recubiertos con matriz de membrana basal a 4 °C y utilícelos dentro de las 2 semanas posteriores al recubrimiento.
nota: Agregue DMEM/F12 adicional a la placa/plato recubierto de matriz de membrana basal para evitar que se seque. Antes de utilizar la placa/plato con recubrimiento de matriz de membrana basal almacenada a 4 °C, colóquela en una cabina de seguridad biológica y deje que alcance la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
- Aspire la matriz de la membrana basal completamente antes de la adición del medio y las células.
>2. Preparación del medio E8
- Prepare el medio de cultivo E8 descongelando el suplemento de E8 durante la noche a 4 °C.
- Retire 10 ml de medio basal E8 del caldo de 500 ml y deséchelo.
- Pipetear todo el vial de 10 ml de E8 suplemento directamente en 490 ml de medio basal E8. No caliente el medio E8 completo en un baño de agua a 37 °C, ya que las fluctuaciones repetidas de temperatura pueden degradar el bFGF en el medio E8 completo.
- Use el medio E8 completo dentro de las 2 semanas posteriores a la adición del suplemento.
>3. Descongelación de iPSCs
- Retire un vial de iPSC congeladas de nitrógeno líquido y colóquelo sobre hielo seco.
- Descongele rápidamente el vial en un baño de agua a 37 °C; agite el vial en el baño de agua hasta que solo quede un pequeño fragmento de hielo.
- Rocíe el vial con etanol al 70% y transfiéralo a una cabina de seguridad biológica.
- Añadir 1 ml de medio E8 a temperatura ambiente gota a gota directamente al vial.
- Con una pipeta de 2 ml, transfiera la suspensión celular gota a gota a 9 ml de medio E8 en un tubo cónico de 15 ml. Gire el tubo con frecuencia para asegurarse de que las celdas y el medio se mezclen bien rápidamente.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un volumen adecuado de E8 suplementado con 10 μM de Y-27632.
- Agregue las celdas a un número adecuado de pocillos recubiertos de matriz de membrana basal y colóquelos en una incubadora de CO₂ a 37 °C al 5% durante la noche. Se recomienda colocar al menos 0,2 x 10⁶ iPSC por pocillo de una placa de 6 pocillos para permitir una recuperación rápida después de la descongelación.
>4. Mantenimiento y Traspaso Rutinario de iPSCs
- Actualice E8 medium todos los días.
- Controle la morfología y la confluencia de las células con un microscopio invertido. Las iPSC de alta calidad crecen en colonias planas con bordes distintos; Las colonias individuales poseen una apariencia de "adoquín".
- Pase las celdas iPSCs cuando alcancen ~70% de confluencia.
- Prepare una solución de paso de EDTA añadiendo 0,9 g de NaCl y 500 μl de EDTA 0,5 M a 500 ml de DPBS. Mezcle bien para disolver el NaCl y filtre al vacío para esterilizar. Calentar una alícuota de la solución de paso en un baño de agua a 37 °C antes del paso.
- Para pasar, aspire el medio de cultivo gastado y lave las celdas una vez con un volumen igual de solución de paso tibia. Aspire y pipetee suficiente solución de paso de EDTA para recubrir las células (1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos).
- Coloque las células bajo un microscopio invertido y observe las colonias de iPSC. La aparición de agujeros dentro de las colonias y bordes elevados debería hacerse evidente dentro de los 2 a 5 minutos.
- Aspire con cuidado la solución de paso EDTA.
- Con una pipeta de 10 ml, dispense 4 ml de medio E8 (si se utiliza una placa de 6 pocillos) a alta presión directamente en cada pocillo que se vaya a pasar.
- Recoja los grupos de iPSC y divídalos en un número adecuado de pocillos en función de la relación de división de 1:8 a 1:12. No pipetee en exceso, ya que la disgregación de los grupos de células dará lugar a una mala viabilidad.
- Coloque la placa en una incubadora y mueva la placa de un lado a otro y de lado a lado varias veces para dispersar las células.
>5. Preparación de MEFs e iPSCs para la transfección
- 48 horas antes de la transfección, el paso de las iPSC a ~1:6 a cuatro o más pocillos de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal, de modo que tengan una confluencia del 70% dentro de dos días.
- Al día siguiente, descongele los MEF DR4 en un medio MEF que consta de DMEM (glucosa alta) suplementado con 10% de FBS y 1x MEM-NEAA.
- Coloque los MEF DR4 en dos placas de 10 cm a ~ 2 x 10⁴ células/cm² e incube durante la noche a 37 °C.
- El día de la transfección, cambie el medio MEF a E8 suplementado con 10 μM Y-27632 30 min antes de realizar la transfección en iPSCs.
- Opcional: 4 horas antes de la transfección, complementar el cultivo de iPSC previo a la transfección con Y-27632 a la concentración final de 10 μM.
>6. Tratamiento con reactivos de disociación de células suaves y transfección de iPSC mediante un sistema de electroporación
- Retire la solución de transfección de células primarias P3 a 4 °C y deje que alcance la temperatura ambiente durante ~30 min. Agregue todo el suplemento de 100 μl a la solución de transfección antes de usar.
- Reactivo de disociación de células suaves tibio en un baño de agua a 37 °C.
- Obtención de TALENs AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 y pZT-AAVS1-R1) y donante de AAVS1-CAG-EGFP a partir de -20 °C.
- Retire las iPSC de la incubadora y lávelas una vez con DPBS.
- Añadir 1 ml de reactivo de disociación de células suaves por pocillo e incubar las iPSC a 37 °C durante 5 min, o hasta que más del 50% de las células se hayan disociado del recipiente de cultivo.
- Pipetear las células hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta p1000 para disociar las células restantes del recipiente de cultivo y para romper los grupos de iPSC.
- Añada 2 ml de medio E8 a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de 10 ml para desagregar aún más los grupos de células en células individuales.
nota: La eficiencia de la transfección disminuye significativamente si los grupos de células no están suficientemente disgregados.
- Recoja las iPSC en un tubo cónico de 15 ml y centrifugue a 100 x g durante 3 minutos.
- Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en una cantidad mínima de medio E8.
- Cuente las células con un hemocitómetro después de la aplicación de una tinción vital como el azul de tripán al 0,4%. Asegúrese de que las células estén suficientemente disociadas durante el recuento (1-3 células por "grupo").
- Dispense 3 pilas de 10⁶ en cada uno de los dos tubos cónicos de 15 ml y vuelva a centrifugar a 100 x g durante 3 min.
nota: La centrifugación a baja velocidad reduce la tensión de la célula y permite una fácil resuspensión de las iPSC antes de la electroporación.
- Ajuste el sistema de electroporación al programa específico del tipo de célula para la línea de células madre embrionarias humanas H9 (Programa CB-150).
- Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante de los gránulos de la célula. A un pellet, añadir 10 μg del donante HR como muestra de control. Al otro pellet se añaden 10 μg del donante HR, junto con 5 μg de cada TALEN (pZT-AAVS1-L1 y pZT-AAVS1-R1) como muestra experimental.
- Vuelva a suspender cada gránulo de célula en 100 μl de solución de transfección de células primarias P3 y transfiéralo a una cubeta.
- Realice la transfección y agregue inmediatamente 500 μl de medio E8 a temperatura ambiente a cada cubeta.
- Transfiera las iPSC transfectadas gota a gota a una placa de 10 cm que contenga MEF DR4 preparada en el paso 5.4.