Integración de genes dirigidos mediada por TALEN: uso de nucleasas específicas de secuencia modificadas para la inserción precisa de genes de proteínas fluorescentes en hiPSC

Abstract

Fuente: Cerbini, T. et al. Transfección, selección y selección de colonias de células madre pluripotentes inducidas humanas dirigidas a TALEN con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

Este video describe una técnica precisa de edición del genoma en células madre pluripotentes inducidas humanas, o hiPSCs, que utilizan TALEN para crear roturas de doble cadena en un locus específico, induciendo la reparación dirigida por homología para la integración de genes de proteínas de fluorescencia.

Protocol

>1. Preparación de la matriz de la membrana basal y recubrimiento de los objetos de plástico

1. Coloque el stock de matriz de membrana basal congelado a -20 °C sobre hielo y descongele durante la noche a 4 °C.
2. Después de la descongelación, pipetear 2 mg de alícuotas de la matriz de la membrana basal en tubos Eppendorf preenfriados. Guárdelos a -20 °C hasta que los necesite.
3. Para preparar placas recubiertas de matriz de membrana basal, descongele una alícuota en hielo hasta que desaparezca el último trozo de hielo en el tubo de Eppendorf (generalmente dentro de ~ 2 horas).
4. Después de la descongelación, agregue la m....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Factor de Crecimiento Reducido (GFR) Matriz de Membrana Basal, *Sin LDEV, 10 ml	Corning	354230	Conservar a -20 °C.
DMEM/F-12	Tecnologías de la Vida	11320-033	Conservar a 4 °C.
Costar 6 pocillos transparentes con tratamiento TC placas de pocillos múltiples	Corning	3506
Esencial 8 Medio	Tecnologías de la Vida	A1517001	Conservar el medio basal a 4 °C. Conservar el suplemento a -20 °C.
Y-27632 diclorhidrato	Tocris	Año 1254	Almacene a temperatura ambiente. Una vez disuelto enH2O, conservar a -20 °C.
cloruro de sodio	sigma	S5886-500G
Ultrapuro 0,5 m EDTA, pH 8,0	Tecnologías de la Vida	15575-020
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Tecnologías de la Vida	14190-250
Plato de cultivo tratado con TC de 100 mm	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Académico	GlobalStem (en inglés)	GSC-6204G	Almacenar en nitrógeno líquido.
DMEM, glucosa alta, piruvato	Tecnologías de la Vida	11995-040	Conservar a 4 °C.
Suero fetal bovino definido, origen en EE. UU.	HyClone	SH30070.03	Conservar a -20 °C. Descongelar a 4 °C durante la noche y alícuota. Almacene las alícuotas a -20 °C hasta que las necesite.
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100X)	Tecnologías de la Vida	11140-050	Conservar a 4 °C.
Unidad central 4D-Nucleofector	Lonza	AAF-1001B	Parte del sistema de electroporación.
Unidad 4D-Nucleofector X	Lonza	AAF-1001X	Parte del sistema de electroporación.
P3 Célula Primaria 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	A su llegada, retire la solución de células primarias y el suplemento y guárdelo a 4 °C.
Reactivo de disociación celular StemPro Accutase	Tecnologías de la Vida	A1110501	Conservar a -20 °C. Descongelar durante la noche a 4 °C y calentar una alícuota en un baño de agua a 37 °C antes de usar.
Medio de cultivo NutriStem XF/FF	Derivante	01-2005	Conservar a -20 °C. Descongelar durante la noche a 4 °C
TALENs AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 y pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 y 52638
AAVS1-CAG-EGFP Donante de recombinación homóloga	Addgene	22212
Dihidrocloruro de puromicina	Tecnologías de la Vida	A11138-03	Conservar a -20 °C. Preparar alícuotas de trabajo de 1 mg/ml en ddH2O.
Pipetas desechables Pasteur de vidrio de borosilicato	Fisher Científico	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (refrigerado), 120 V 60 Hz	Termo Científico	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Rotor de cubo oscilante	Termo Científico	75003607
Solución de azul de tripano, 0.4%	Tecnologías de la Vida	15250-061