phiC31-Integración de transgenes dirigidos en el sitio mediada por integrasa: una técnica de microinyección para la integración de transgenes específicos del sitio en un vector Anopheles

1. Preparación de plásmidos para la mezcla de microinyección

NOTA: El protocolo ilustrado aquí implica el uso de dos plásmidos: un plásmido donante marcado con attB (sitio de unión derivado de la bacteria huésped) que lleva el transgén de interés, y un plásmido auxiliar que expresa la integrasa φC31 bajo la regulación del promotor Hsp70 de Drosophila.

1. Purifique los plásmidos donantes y ayudantes utilizando un kit de purificación de plásmidos libre de endotoxinas.
   nota: Secuenciar la preparación final del plásmido utilizada para la inyección para verificar la integridad de todos los componentes.
2. Combine las cantidades adecuadas de los dos plásmidos para obtener una mezcla con una concentración final de 350 ng/μL del plásmido donante y 150 ng/μL del plásmido auxiliar cuando se resuspende en el tampón de inyección.
   nota: Al calcular el volumen necesario de mezcla, tenga en cuenta que 10-15 μL son suficientes para cada día de inyecciones planificadas y el ADN se puede preparar con anticipación y almacenar a -20 °C. También se han reportado concentraciones de plásmidos auxiliares de integrasa de 60-500 ng/μL y concentraciones de plásmidos donantes de 85-200 ng/μL.
3. Precipite el ADN añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de EtOH 100% frío como hielo y vórtice. Un precipitado blanco debe ser inmediatamente visible. Tener preparaciones iniciales de plásmidos altamente concentradas (es decir, ~1 μg/μL) mejora la eficiencia de la precipitación.
   nota: Punto de parada: el precipitado se puede almacenar a -20 °C durante la noche.
4. Centrifugar a 15.000 x g durante 20 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de EtOH 70% helado.
5. Lavar el pellet con 1 mL de EtOH 70% helado y centrifugar a 15.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Deseche el sobrenadante sin alterar el pellet y séquelo al aire.
7. Vuelva a suspender el pellet en 1x tampón de inyección (0,1 mM Na,₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm, filtro esterilizado) para alcanzar una concentración final total de 500 ng/μL.
   nota: Supongamos que se perderá algo de ADN durante el proceso de precipitación; por lo tanto, primero agregue un volumen más pequeño de tampón de inyección, verifique la concentración en un espectrofotómetro (por ejemplo, Nanodrop) y luego agregue un volumen restante adecuado para alcanzar 500 ng/μL.
8. Asegúrese de que el ADN se resuspenda completamente, prepare alícuotas de 10-15 μL cada una y guárdelas a -20 °C.
9. El día de la inyección, descongele una alícuota y centrifugue a 15.000 x g durante 5 minutos para eliminar cualquier residuo de partículas.
   NOTA: Un método alternativo para la eliminación de partículas es filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Evite la presencia de residuos de partículas en la mezcla de inyección, ya que provocan el bloqueo de la aguja durante la microinyección del embrión.

>2. Microinyección de embriones de una línea de acoplamiento de Anopheles

1. La alimentación sanguínea de los mosquitos de 4 a 7 días de edad desde la línea de acoplamiento deseada 72 horas antes de la microinyección (es decir, para la inyección el lunes y el martes, alimente a las hembras el viernes anterior; para la inyección el jueves y el viernes, alimente a las hembras el lunes de la misma semana).
2. La sangre alimenta a los mosquitos de tipo salvaje (WT) (es decir, mosquitos con el mismo fondo genómico de la línea de acoplamiento) el mismo día; estos serán necesarios para el cruzamiento><. nota: El tamaño y la calidad de la harina de sangre afectan la calidad del huevo, por lo que se recomienda utilizar siempre sangre fresca (es decir, sangre extraída en los 7 días anteriores). La alimentación con el brazo o la alimentación de ratones puede aumentar la calidad y la cantidad de huevos, sin embargo, estos métodos no se recomiendan. Serán necesarios protocolos específicos aprobados para el uso humano y animal.
3. Realizar microinyecciones de embriones
   1. Realizar microinyecciones de embriones de An. gambiae en NaCl de 25 mM dirigiéndose al polo posterior del embrión en un ángulo de 45 grados. Para obtener un protocolo detallado para la recolección, alineación y microinyección de embriones, consulte Pondeville et al.y Lobo et al.
   2. Realice microinyecciones de embriones de An. stephensi en aceite de halocarbono 700:27 (2:1) apuntando el polo posterior del embrión en un ángulo de 30 grados. Un protocolo detallado para la recolección, alineación y microinyección de embriones se puede encontrar en Terenius et al.y Lobo et al.
   3. Transfiera los huevos inmediatamente después de la inyección a una placa de Petri llena de agua destilada estéril (pH 7,2) y devuélvalos a las condiciones de insectario.
4. Al eclosionar, transfiera las larvas G₀ a una bandeja con agua destilada con sal (0,1% de sal tónica) diariamente y críelas hasta las pupas.
5. Tasa de eclosión récord (es decir, número de larvas eclosionadas/número de embriones inyectados).
   nota: El movimiento del embrión ayuda a la eclosión, por lo que es deseable un remolino suave. La eclosión debe comenzar ~ 48 h después de la inyección. Dado que la inyección puede causar un ligero retraso en el desarrollo, es aconsejable mantener el seguimiento de las larvas de eclosión tardía durante 3-4 días.