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Silenciamiento génico basado en interferencias CRISPR: una técnica para la represión dirigida de la función génica en leptospira patógena

8 de julio de 2025

En este artículo

Resumen

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Fuente: Fernandes, L. G. V., et al. Aplicación de la interferencia CRISPR (CRISPRi) para el silenciamiento génico en especies patógenas de Leptospira. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un silenciamiento génico basado en interferencias CRISPR en Leptospira patógena. La represión dirigida de la expresión génica mediante un sistema CRISPR/Cas que bloquea la formación de ARNm ayuda a identificar genes candidatos para estudios patológicos y farmacológicos.

Protocolo

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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Definición de protoespaciador y construcción de plásmidos

NOTA: En esta sección, se describe el primer paso de la selección de protoespaciadores apropiados para construir el sgRNA y su posterior ligadura en pMaOri.dCas9, (Figura 1). Esta secuencia protoespaciadora se compone de una secuencia de 20 nucleótidos contra el objetivo deseado.

  1. Obtener la secuencia de nucleó....

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Resultados

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El casete de sgRNA debe ser:
cccgggGAACAAGAAAGAGTCAGAGAATTATTGAAGAGATACTCTTATACTACCGTCTTTGGAAGAATTTTCGCATGGATTTTAGATTTGCTGGACTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAAGCGATTTTTTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA.......

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Divulgaciones

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No se han declarado conflictos de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Membrana de ésteres de celulosa mixta con un tamaño de poro de 0,1 μmMilliporeVCWP02500Filtración para la conjugación bacteriana
Ácido 2,6-diaminopimélico (DAP)sigmaD1377Crecimiento de E. coli auxotrófica β2163
Agar NobleBD & Company214230Se utiliza para la preparación de placas sólidas EMJH y HAN
Bacto AgarBD & Company214010Se utiliza para la preparación de placas sólidas LB
Portafiltros de microanálisis de vidrioMilliporeXX1012530Filtración para la conjugación bacteriana
Caldo LB, MolineroBD & Company244620Medio líquido lisogénico para el cultivo de E. coli
Enriquecimiento de Leptospira EMJHBD & Company279510Suplementación de los medios EMJH
Leptospira Base Media EMJHBD & Company279410Medio EMJH para Leptospira
Lector de densidad ópticaDispositivos molecularesSpectraMax M2Para mediciones de densidad óptica de cultivos bacterianos
EspectinomicinasigmaS0692Selección de plásmidos de la columna vertebral pMaOri
Timidina (dT)sigmaT9250Crecimiento de E. coli auxótropa π1
Enzima de restricción XmaINuevo Englan BioLabsR0180LDigestión de plásmidos e insertos

Reimpresiones y permisos

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Etiquetas

CRISPR InterferenceGene SilencingdCas9 ProteinShuttle VectorConjugation ProtocolLeptospira BacteriaDark Field MicroscopySpectinomycin SelectionHAN MediaPlasmid Construct

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