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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Definición de protoespaciador y construcción de plásmidos
NOTA: En esta sección, se describe el primer paso de la selección de protoespaciadores apropiados para construir el sgRNA y su posterior ligadura en pMaOri.dCas9, (Figura 1). Esta secuencia protoespaciadora se compone de una secuencia de 20 nucleótidos contra el objetivo deseado.
- Obtener la secuencia de nucleótidos del gen de interés para silenciar en GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Envíelo al servidor web CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), con los parámetros definidos para Streptococcus pyogenes Cas9 y el motivo adyacente del protoespaciador NGG después de seleccionar el "Objetivo Fasta". Defina los parámetros a "CRISPR/Cas9" y PAM (motivo adyacente al protoespaciador) NGG.
- Con base en los resultados obtenidos, seleccione los protoespaciadores con la mejor puntuación posible (flecha verde), que estén ubicados lo más cerca posible del extremo 5' de la región codificante y, lo que es más importante, estén contenidos en la hebra molde (menos), ya que el sgRNA debe emparejarse con la hebra codificante del gen para el silenciamiento completo del gen.
nota: El motivo NGG no se incluye en la secuencia final de sgRNA.
- Utilice el promotor lipL32 para expresar el ARN guía único que contiene una secuencia variable de 20 nucleótidos en el extremo 5' y una secuencia de andamio dCas9 conservada. Fusionar la secuencia de 20 nt, denominada protoespaciador, con el promotor lipL32 (en su extremo 5') y el andamio de sgRNA (extremo 3') (Figura 1B).
nota: Para obtener un promotor lipL32 bien definido, utilice la región promotora que comprende -334 al TSS (sitio de inicio de transcripción, basado en Zhukova et al.). Consulte la Tabla 1 para ver el casete de sgRNA final.
- Genere el casete de sgRNA por PCR secuencial o haga que un proveedor comercial lo sintetice.
- Después de obtener el casete, ligarlo en el plásmido pMaOri.dCas9 en el sitio de restricción XmaI en ambos extremos (cccggg).
- Digiera tanto el casete de sgRNA como el plásmido pMaOri.dCas9 con la enzima de restricción XmaI y proceda a la ligadura (Figura 1B).
- Realice los pasos de clonación en la cepa de E. coli auxótropa dT π1, debido al origen de replicación pMaOri (y por extensión, pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
NOTA: Para obtener un protocolo detallado para la ligadura y la selección de clones, consulte las publicaciones anteriores de Fernandes y Nascimento. dCas9 guiado por sgRNA se unirá a la cadena codificante del gen seleccionado de interés y, por lo tanto, obstruirá la elongación de la ARN polimerasa (Figura 1C), lo que resultará en el silenciamiento del gen.
>2. Transformación de Leptospira por conjugación
NOTA: En la Figura 2 se presenta un esquema gráfico de este paso. Para hacer medios HAN y placas HAN, consulte Hornsby et al. y Fernandes et al.
- Cultivar células patógenas de Leptospira a 29 o 37 °C en medios HAN bajo agitación diluyendo un cultivo saturado en HAN fresco a 1:100; típicamente, L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 tarda 4-6 días en alcanzar la densidad celular adecuada.
- Asegúrese de que los cultivos alcancen un diámetro exterior de 0,2-0,4 a 420 nm (2 a 5 x 108 células/mL) antes >nota: Dado que el medio HAN cambia de color a medida que aumentan las densidades celulares (debido al rojo de fenol contenido en el medio DMEM), centrifugar (4,000 x g, 15 min, temperatura ambiente) 1 mL del medio de cultivo para eliminar las leptospiras y aplicar sobrenadante como un blanco para medir el diámetro exterior.
- Transformar la cepa conjugativa de E. coli β2163, auxótrofa para el ácido diaminopimélico (DAP), con el plásmido pMaOri.dCas9 que contiene el casete de sgRNA. Para la transformación de E. coli, utilice protocolos de choque térmico o electroporación. Incluya la transformación con el plásmido pMaOri.dCas9 sin casete de sgRNA como control.
- Para la transformación por choque térmico, mezcle el ADN plasmídico (100 ng) con células de E. coli químicamente competentes e incube en hielo durante 30 min. Realice el choque térmico a 42 °C durante 90 s y vuelva a colocarlo en hielo durante 5 min. Recupere las células añadiendo 1 mL de medio LB, incube a 37 °C durante 1 h y proceda al enchapado.
- Para la electroporación, utilice células electrocompetentes mezcladas con 100 ng de ADN plasmídico. Utilice los siguientes parámetros para el pulso: 1,8 kV, 100 Ω y 25 μF. Recupere las celdas como se explicó anteriormente.
- Coloque las células de E. coli donantes transformadas en medio agar LB suplementado con ácido diaminopimélico (DAP) (0,3 mM) y espectinomicina (40 μg/mL) para seleccionar plásmidos.
- Para la conjugación, seleccione una colonia de cada placa un día antes del día de la conjugación (que se determina mediante el seguimiento de la diámetro exterior de los cultivos de leptospiras).
- Seleccione una colonia de E. coli β2163 de las placas vacías de pMaOri.dCas9 y una de las placas pMaOri.dCas9sgRNA. Déjelos crecer durante la noche en 10 mL de LB más DAP y espectinomicina a 37 °C.
- Al día siguiente, diluir los cultivos saturados 1:100 en 10 mL de LB fresco más DAP (no incluya el antibiótico aquí) hasta un diámetro exterior de420 nm de 0,2-0,4. Normalmente, la E. coli tarda entre 2 y 3 horas en alcanzar estas densidades.
- Dentro de una campana de bioseguridad BSL2, ensamble un aparato de filtración colocando un filtro de membrana de ésteres de celulosa mixta de 25 mm de diámetro y 0,1 μm de tamaño de poro en la parte superior de la base de vidrio. Coloque un embudo de vidrio de 15 ml en la parte superior y sujete ambas piezas con abrazaderas de resorte. Conecte el vidrio a una bomba de vacío y agregue los cultivos al embudo para la filtración.
- Agregue 5 ml de cultivo de Leptospira al embudo. Agregue un volumen de E. coli para constituir la proporción 1:1 basada en los valores deOD 420 nm de ambos cultivos. Encienda la bomba de vacío y las celdas de concentración por filtración. Después de la concentración de células en el filtro de membrana, recupérelo con cuidado. Asegúrese de que el medio se filtre a través de la membrana.
nota: La filtración tarda de 5 a 10 min.
- Coloque el filtro en una placa EMJH disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales) complementada con DAP (0,3 mM). Asegúrese de que el lado de las bacterias esté hacia arriba. Incubar las placas a 29 °C durante 24 h.
nota: Si se utilizan placas HAN o EMJH suplementadas internamente, E. coli puede proliferar y superar la proporción 1:1 prevista, lo que a su vez puede disminuir la eficiencia de la conjugación.
- Después de 24 h, recupere los filtros de las placas y coloque cada filtro individual en un tubo cónico de 50 mL.
- Utilice 1 ml de medio HAN líquido para liberar las células de la superficie del filtro mediante un pipeteo y vórtice extensos.
- Visualizar las soluciones bacterianas mixtas recuperadas mediante microscopía de campo oscuro para comprobar la viabilidad y motilidad celular, y las proporciones de Leptospira:E. coli.
nota: En esta etapa, se pueden observar números equivalentes de E. coli y Leptospira.
- Extienda 100-200 μL de este cultivo en placas HAN que contengan 0,4% de suero de conejo inactivado y 40 μg/mL de espectinomicina. Incubar las placas a 37 °C en una atmósfera con 3% deCO2.
NOTA: Normalmente, las células >de L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 forman colonias en 5-7 días en placas de control y en 8-10 días en placas de espectinomicina. En esta etapa, E. coli no crecerá ya que son auxotróficas para DAP.
- Como control, diluir los cultivos a 104 leptospiras/mL y añadir 100 μL en placas sin antibiótico, para monitorizar el crecimiento de leptospirales.