Silenciamiento génico in vitro basado en transfección inversa de siRNA: un procedimiento para administrar pequeño ARN interferente en células cultivadas para inactivar la expresión génica diana

Resumen

Fuente: Jager, J. et al.Un modelo de cultivo de células de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y micro-ARN en la función de los adipocitos. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, describimos un procedimiento para realizar la transfección inversa de siRNA en adipocitos para modular la expresión de una proteína diana.

Protocolo

1. Preparación de placas prerrevestidas

1. El día anterior o unas horas antes de la transfección, prepare una solución de colágeno tipo I a 100 μg/mL en etanol al 30% a partir de una solución madre a 1 mg/mL. Agregue 250 μL de colágeno por pocillo de una placa de 12 pocillos y 125 μL por pocillo de una placa de 24 pocillos, y extienda la solución sobre la superficie del pocillo.
2. Deje la placa sin tapa debajo de la campana de cultivo hasta que el colágeno se seque. Lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) de Dulbecco.
   NOTA: Las placas prerrevestidas están disponibles para su compra.

>2. Preparación de la mezcla de transfección

NOTA: La concentración final de siRNA está entre 1 y 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por pocillo de una placa de 12 pocillos). La concentración final del imitador miR es de 10 nM (10 pmol/pocillo). Determine la mejor concentración de cada siRNA, miR mimic u otro oligonucleótido antes de comenzar el experimento para evitar efectos fuera del objetivo. Realizar experimentos de transfección por triplicado para facilitar el análisis estadístico de los resultados. Prepare todos los reactivos en exceso para tener en cuenta la pérdida normal durante el pipeteo.

1. Mezclar pipeteando (volumen/volumen) el siRNA (u otros oligonucleótidos) con un Medio Esencial Mínimo mejorado (Tabla 1). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Añada el reactivo de transfección y el medio esencial mínimo mejorado al siRNA y la pipeta para mezclar (Tabla 1). Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente (durante este tiempo, proceda a la sección 3). Agregue la mezcla de transfección a cada pocillo del plato recubierto de colágeno.

>3. Preparación de los adipocitos 3T3-L1

1. Lave las células en la placa de Petri de 100 mm dos veces con D-PBS. Añadir 5x tripsina a las células (1 mL por plato de 100 mm), asegurándose de cubrir toda la superficie con la tripsina. Espere 30 s y retire con cuidado la tripsina.
2. Incubar la placa de Petri durante 5-10 min a 37 °C en la incubadora. Golpee el plato de 100 mm para separar las celdas.
3. Añadir 10 ml de DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de FCS y 1% de penicilina y estreptomicina para neutralizar la tripsina. Pipetear con cuidado el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular.
4. Cuente las células utilizando una cámara de recuento Malassez o un contador de células automatizado, y ajuste la concentración de las células a 6,25 x 10⁵ células/mL de medio. Siembra 800 μL de la suspensión/pocillo celular de una placa de 12 pocillos (5 x 10⁵ celdas) o 400 μl de la suspensión/pocillo celular de una placa de 24 pocillos (2,5 x 10⁵ celdas) que contiene la mezcla de transfección.
   nota: Una placa de Petri de 100 mm de adipocitos permitirá la preparación de una placa de 12 pocillos o una placa de 24 pocillos. Una placa de 100 mm suele contener 6-7 x 10⁶ adipocitos, que corresponden a 5 x 10⁵ adipocitos por pocillo de una placa de 12 pocillos.
5. Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular (7% de CO2 y 37 °C) y no perturbar las células durante 24 h. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de FCS y 1% de penicilina y estreptomicina.
   NOTA: También es posible sembrar las células en placas de 48 y 96 pocillos prerrecubiertas de colágeno, pero tome más precauciones al reemplazar el medio para evitar el desprendimiento de los adipocitos.

	Por pocillo (placa de 12 pocillos)	Por pocillo (placa de 24 pocillos)
Oligonucleótidos	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
Medio esencial mínimo mejorado	20 μL	10 μL
Reactivo de transfección	5,6 μL	2,8 μL
Medio esencial mínimo mejorado	154,4 μL	77,2 μL
Volumen total de la mezcla de transfección	200 μL	100 μL

Tabla 1: Reactivos de transfección necesarios para formatos de placa de 12 y 24 pocillos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos	Dutscher	353043
2.5% Tripsina (10x)	Gibco	15090-046	Diluido a 5x con D-PBS
2-Propanol	sigma	I9516
3-isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	D5879
Albúmina sérica bovina (BSA)	sigma	A7030
Colágeno tipo I de la piel de becerro	Sigma-Aldrich	C8919
dexametasona	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Medio de águilas modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 g/L de D-glucosa; L-glutamina; sin piruvato
etanol	sigma	51976
El micro-ARN de miRIDIAN imita	Descubrimiento de horizontes
ARNip de control negativo marcado con FAM	Invitrogen	AM4620
Suero para terneros recién nacidos	Gibco	16010-159
Suero Fetal Bovino	Gibco	10270-106
Penicilina y estreptomicina	Gibco	Números 15140-122
ARNip de control negativo marcado con FAM	Invitrogen	AM4620
ON-TARGETplus Ratón Plin1 siRNA SMARTpool	Descubrimiento de horizontes	L-056623-01-0005
Reactivo de glicerol libre	Sigma-Aldrich	F6428
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
Reactivo de transfección (INTERFERin)	Polyplus	409-10
Medio Esencial Mínimo Mejorado (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulina Recombinante Humana	Gibco	12585-014