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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Transfección del plásmido de respuesta que expresa el gen de interés (GOI) en células epiteliales alveolares primarias
- Aislar células epiteliales alveolares de tipo II de pulmones de rata.
- Siembre las células a una densidad de 1 x 106 células/cm2 en placas de Petri de 100 mm con medio esencial mínimo completo (MEM completo). La MEM completa es MEM suplementada con 10% de FBS, 0,08 mg/L de tobramicina, Septra (3 μg/mL de trimetoprima y 17 μg/mL de sulfametoxazol), 0,2% de NaHCO3, 0,01 M de HEPES (pH = 7,3) y 2 mM de L-glutamina. Cultivar las células durante 24 h a 37 °C en CO2 al 5% en una incubadora humidificada.
- Al día siguiente, coloque 500 μL de MEM completo sin antibiótico en cada pocillo de una nueva placa de 12 pocillos y precaliente la placa a 37 °C durante 30 min. Durante este paso, es importante utilizar suero fetal bovino libre de tetraciclinas contaminantes o con un nivel demasiado bajo para interferir con la inducibilidad.
- Prepare tubos de 1,5 mL que contengan el plásmido con el GOI inducible (plásmido GOI) y el vector regulador (p. ej., pTet-Off) añadiendo 1 μg de plásmido GOI y 1 μg de vector regulador por pocillo en RT. Para los experimentos de coexpresión con proteínas de unión al ARN (RBP), se añade a la mezcla de ADN 1 μg de un vector constitutivo (por ejemplo, pcDNA3) que expresa el RPB de interés (Figura 4).
- Aspirar el medio y enjuagar suavemente las células con PBS (sin calcio ni magnesio) precalentado a 37 °C.
- Añadir 5 mL de tripsina al 0,05% precalentada a 37 °C e incubar las células hasta que se desprendan (2-4 min). Neutralizar la tripsina añadiendo 10 mL de MEM completa sin antibiótico.
- Recoja la suspensión celular en un tubo de 50 mL, lave la placa de Petri con 4 mL de medio para recolectar tantas celdas restantes como sea posible y luego centrifugue la suspensión celular a 300 x g durante 5 min.
- Aspire suavemente y deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS. Cuente y calcule el número de células con un hemocitómetro.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Aspirar suavemente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el tampón de resuspensión a una concentración de 4 x 107 células/mL. Añada las células del tubo de 1,5 ml preparado en el paso 2.4 a una concentración de 400.000 células por pocillo y mézclelas suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Coloque el tubo en el dispositivo de electroporación y llénelo con 3,5 mL de tampón electrolítico.
- Inserte una punta de electrodo chapada en oro en una pipeta presionando completamente el pistón. Mezcle suavemente el contenido del tubo de 1,5 ml y aspire cuidadosamente las células con la pipeta. Tenga cuidado de evitar que entren burbujas de aire en la punta, ya que esto causará arcos eléctricos durante la electroporación y disminuirá la eficiencia de la transfección.
- Inserte la pipeta en la estación de electroporación hasta que se escuche un clic.
- Seleccione el protocolo de electroporación adecuado para las células epiteliales alveolares, correspondiente a una tensión de pulso de 1.450 V y 2 pulsos con una anchura de 20 ms, y pulse Inicio en la pantalla táctil.
- Inmediatamente después de la transfección, retire la pipeta y transfiera las células a un pocillo previamente lleno de MEM completo sin antibiótico que se haya precalentado a 37 °C.
- Repita los pasos 1.11-1.14 para las muestras restantes.
- Agite suavemente la placa para distribuir las células de manera uniforme sobre la superficie del pocillo. Incubar las células a 37 °C en 5% de CO2 en una incubadora humidificada. Después de 2 días, reemplace el medio con MEM completo con antibióticos.
- Confirme el éxito de la transfección observando la expresión de eGFP bajo un microscopio de fluorescencia o mediante citometría de flujo utilizando un vector de control (Figura 1).
nota: Este paso es opcional y requiere un paso de transfección adicional utilizando un plásmido diferente que exprese eGFP, como pcDNA3-EGFP.
>2. Inducción de la inhibición de la transcripción del GOI
NOTA: Las células pueden ser pretratadas con los tratamientos deseados antes de la inducción de doxiciclina para evaluar su impacto en la estabilidad del ARNm (Figura 3).
- Prepare una solución madre de doxiciclina de 1 mg/mL en agua desionizada. Almacene la solución madre a -20 °C protegida de la luz. La doxiciclina, un derivado de la tetraciclina, se usa en lugar de la tetraciclina porque tiene una vida media más larga (2x) que la tetraciclina. Además, se requiere una concentración más baja de doxiciclina para la inactivación completa del operón tet.
nota: La doxiciclina podría afectar a la expresión de ARNm del GOI endógeno. Para verificar esto, se debe evaluar el efecto de un tratamiento de 24 h con doxiciclina en las células alveolares para confirmar la ausencia de cambios en la expresión de GOI (Figura 2).
- Preparar una solución fresca de 1 μg/mL de doxiciclina en MEM completa 72 h después de la transfección y calentarla a 37 °C.
- Reemplace el medio con 1 mL de MEM completo que contenga 1 μg/mL de doxiciclina por pocillo para inhibir la transcripción del GOI.
- Incubar varios pocillos a 37 °C en 5% de CO2 durante diferentes períodos de tiempo de 15 min a 6 h para evaluar la vida media del ARNm del GOI.
- Al final del tratamiento, lavar las células con PBS helado y liarlas con un kit de extracción de ARN de fenol-cloroformo disponible en el mercado añadiendo 500 μL de tampón por pocillo y agitando la placa para homogeneizar las células.
- Aísle el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Determine el rendimiento y la pureza del ARN mediante espectrofotometría a 230, 260 y 280 nm. Las muestras de ARN con proporciones 260:230 y 260:280 de 1,8 y 2,0, respectivamente, se consideran puras.
nota: El protocolo se puede pausar aquí.
