Transformación de genes basada en vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios en plantas de Arabidopsis: una técnica para generar plantas transgénicas con inserción de una sola copia

1. Arabidopsis Transformación

1. Preparar las plantas de Arabidopsis para la transformación.
   1. Cultive plantas de Arabidopsis en un invernadero o cámara de crecimiento climatizada hasta que estén floreciendo (12 macetas con 9 plantas cada una por inmersión).
   2. Sujete los primeros pernos para permitir que emerjan más pernos secundarios. Las plantas están listas para sumergirse 4-6 días después del recorte, cuando las plantas tienen muchas cabezas de flores inmaduras y no muchas silicuas fertilizadas.
2. Inmersión floral
   1. Sumerja las inflorescencias durante 5-10 segundos en una suspensión de Agrobacterium que lleva ADN-T clonado con cromosoma artificial bacteriano binario o BIBAC. Agita suavemente.
   2. Envuelva las partes aéreas de las plantas en una película adhesiva para mantener la humedad alta y cubra las macetas con una caja para mantener las plantas en la oscuridad. Incubar las plantas durante 2 días en un invernadero/cámara de crecimiento.
   3. Retire la caja y la película adhesiva y cultive las plantas hasta la madurez en un invernadero / cámara de crecimiento.
      nota: Para aumentar la eficiencia de la transformación, las mismas plantas se pueden volver a sumergir 7 días después de la primera inmersión.
   4. Cosecha las semillas. Agrupa y analiza las semillas (T1) de plantas, transformadas con el mismo constructo, como un solo conjunto.
3. Criba para plantas transgénicas.
   1. Para detectar plantas transgénicas transformadas con un derivado de pBIBAC-RFP-GW, analice las semillas utilizando microscopía de fluorescencia. Para detectar la expresión de DsRed en las cubiertas de las semillas, obtenga imágenes de las semillas a una excitación de 560 nm y una emisión de 600-650 nm. Separe las semillas fluorescentes de las contrapartes no fluorescentes con pinzas.
   2. Para detectar plantas transgénicas transformadas con un derivado de pBIBAC-BAR-GW, siembre las semillas en bandejas llenas de tierra (~2.500 semillas/0,1^m2). Para asegurar una distribución uniforme de las semillas sobre las bandejas, suspenda las semillas en agar al 0,1% en medio Murashige Skoog 0,5x (MS) y extienda las semillas con una pipeta de 1 mL.
      nota: Para estimular la germinación sincronizada de las semillas, incubar las semillas durante al menos 2 días a 4 °C. Esto se puede hacer antes o después de sembrar las semillas.
      1. Rocíe las plántulas con una solución de glufosinato de amonio al 0,5% 2 semanas y 3 semanas después de la siembra en bandejas. Utilice 500 ml de solución de glufosinato de amonio por 1 m².
      2. Transfiera las plántulas sobrevivientes a macetas individuales. En la Figura 1 se muestra una imagen típica de una bandeja con plántulas antes y después del (segundo) tratamiento con glufosinato y amonio.
      3. Analice las plantas resistentes al glufosinato de amonio por PCR para detectar la presencia del constructo de interés.
         1. Aislar el ADN genómico de la planta para la PCR.

Figura 1: Bandeja llena de plántulas de Arabidopsis antes y después del tratamiento con glufosinato de amonio. Las plántulas que no expresan el gen bar que está presente en el adn t pBIBAC-BAR-GW mueren después de ser rociadas con una solución de glufosinato de amonio. Las fotos muestran la misma bandeja de plántulas (A) antes de rociar con glufosinato de amonio, 14 días después de la siembra y (B) 10 días después, después de ser rociadas dos veces.