Edición de genes mediada por morfolinos: una técnica de eliminación de genes que utiliza oligonucleótidos de morfolino bloqueantes traslacionales en huevos unicelulares de peces de cueva

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Diseño de oligonucleótidos morfolinos

NOTA: Las secuencias de A. mexicanus están disponibles a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Gene y NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), así como del navegador del genoma Ensembl (https://www.ensembl.org). Al diseñar un morfolino para su uso tanto en la superficie como en cuevas, es fundamental identificar cualquier variación genética entre los morfos en esta etapa, de modo que estas regiones genéticas puedan evitarse como objetivos para los morfolinos. Cualquier variación polimórfica dentro de un sitio objetivo de morfolino puede conducir a una unión ineficaz. El diseño es similar al de otros sistemas de peces, como el pez cebra, y se ha demostrado previamente que funciona eficazmente en A. mexicanus.

1. Diseño de morpholinos
   nota: Los morfolinos que bloquean la traducción bloquean la traducción al unirse al sitio de inicio endógeno e impiden que la maquinaria de traducción se una a la secuencia de ARNm a través de un obstáculo estérico.
   1. Identifique la región codificante del gen objetivo a partir del sitio de inicio de ATG.
   2. Registre los primeros 25 pares de bases de la secuencia objetivo copiando y pegando la secuencia en un editor de texto o cuaderno de laboratorio.
   3. Utilizando software en línea (por ejemplo, http://reverse-complement.com) o traducción manual, genere el complemento inverso de la secuencia objetivo. Guarde el complemento inverso resultante en un editor de texto o en un cuaderno de laboratorio.
   4. Pida un morfolino con la secuencia inversa del complemento a una empresa que genere oligonucleótidos de morfolino. Ver Tabla de Materiales para empresas.

>2. Microinyecciones

1. Preparación de herramientas generales para inyecciones
   nota: Los procedimientos de esta sección se han descrito en detalle en otra parte, y aquí se presenta una descripción general con modificaciones menores.
   1. Genere placas de inyección vertiendo agarosa tibia al 3% disuelta en agua del sistema de peces en una placa de Petri de 100 mL. Coloque con cuidado un molde de inyección de huevos en la agarosa recién vertida para hacer pozos para los huevos de pescado. Coloque el lado del molde en agar en un ángulo de 45 ° y luego, bájelo lentamente en la agarosa; Bajar lentamente el molde en ángulo evita que el aire quede atrapado debajo del molde. Retire suavemente el molde una vez que la agarosa se haya solidificado. Las placas pueden almacenarse, selladas, a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
2. Recolección de óvulos en etapa unicelular
   1. La noche en la que se espera la reproducción, examine los tanques cada 15 a 30 minutos y controle si hay huevos en el fondo del tanque. Los huevos parecen translúcidos, miden aproximadamente 1 mm de diámetro.
   2. Use una red de pesca de malla fina para recolectar los huevos y transfiéralos a un recipiente de vidrio lleno de agua fresca del sistema de pescado. Examine los óvulos bajo un microscopio para confirmar que los óvulos están en la etapa de una célula.
   3. Con pipetas de vidrio, transfiera los óvulos unicelulares a las placas de inyección. En esta etapa se requieren pipetas de vidrio, ya que los huevos se adherirán al plástico.
   4. Con una pipeta, libere con cuidado los huevos en los pocillos de la placa de inyección de agarosa de la sección 2.1. Llene las filas de la placa de inyección precalentada (a temperatura ambiente) con el número máximo de huevos (30-40 por fila y hasta cinco filas). Las filas completas ayudan a evitar que los huevos se muevan durante las inyecciones. Mantenga los huevos hidratados en la placa de inyección con una pequeña cantidad de agua del sistema de peces hasta la realización de las inyecciones.
3. Configuración de la picoinyección y directrices generales de optimización de la inyección
   1. Rellene las agujas de inyección con puntas de pipeta con carga de gel que encajen dentro del capilar o con puntas de micropipeta estándar y añada un bolo de 2-4 μL al extremo. Una vez que la aguja esté llena, use pinzas para recortar el exceso de longitud de la aguja de inyección.
   2. Realizar microinyecciones utilizando una aguja montada en un micromanipulador, conectado a un microinyector de picolitros.
   3. Ajuste el tiempo de inyección a 0,03 s y la presión a ~0,0 psi. La presión de inyección variará en consecuencia con pequeñas diferencias entre las agujas, por lo que debe optimizar para lograr un bolo de inyección de ~ 1.0 nL.
      nota: La presión de inyección suele estar en el rango de ~10-30 psi.
   4. Estandarice el bolo de inyección inyectándolo en aceite mineral y midiendo el tamaño del bolo con un micrómetro deslizante para lograr un volumen de inyección de ~1-1,5 nL. Ajuste la presión de inyección (psi) para aumentar o disminuir el volumen del bolo.
   5. Extraiga agua de la parte superior de los huevos con un pañuelo de laboratorio.
      nota: El corion de huevos de Astyanax es ligeramente más difícil de penetrar que los huevos de pez cebra. Descubrimos que extraer el agua de la parte superior de los huevos ayuda a facilitar la penetración de la aguja en el huevo. La optimización del plato puede permitir ~ 200 huevos en un solo plato.
   6. Utilice el micromanipulador para penetrar cada huevo con la aguja e inyectarlo directamente en la yema. Una vez colocado en la yema, inyecte el huevo presionando el botón de inyección o el pedal de inyección.
      nota: Se puede inyectar una placa completa en ~ 15 min. La etapa de una sola celda dura ~40 min.
4. Inyección de morfolinos
   nota: La cantidad de morfolino necesaria para la eliminación sin causar toxicidad deberá optimizarse por gen objetivo; Sin embargo, una concentración de 400 pg es un buen punto de partida.
   1. Prepare el morfolino de manera que se inyecten 400 pg de morfolino por huevo. Descongele el morfolino en hielo. La solución inyectable está compuesta por morfolino (a la concentración deseada), H2O libre de RNasa o solución de Danieau, y rojo de fenol (10% del volumen final). Para ver un ejemplo, consulte la Tabla 1.
   2. Inyectar 1 nL por embrión.