Transgénesis del pez cebra mediada por transposones Tol2: un procedimiento para generar peces cebra transgénicos tras la coinyección del sistema Tol2 en embriones fertilizados de pez cebra

Resumen

Fuente: Silic, M. R., et al. Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos y tumores de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, demostramos un procedimiento para generar una línea transgénica estable de pez cebra que expresa constitutivamente una proteína indicadora de voltaje fluorescente después de la coinyección del sistema de transposón Tol2 que comprende el ARNm de la transposasa y la construcción del transposón Tol2 que codifica el indicador de voltaje fluorescente.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Microinyección

1. Instale de 4 a 6 tanques de cría con al menos 2 machos y 2 hembras la tarde antes de la inyección. Estos peces no deben ser alimentados por la tarde. Este paso reducirá la cantidad de desechos de peces y ahorrará tiempo para limpiarlos a la mañana siguiente, al mismo tiempo que ayudará a inducir una respuesta de reproducción.
A
2. la mañana siguiente, retire la solución inyectable preparada compuesta por: (i) una construcción de transposón Tol2 que contiene un promotor de ubiquitina de pez cebra y el gen indicador de voltaje fluorescente Sensor Acelerado de Potenciales de Acción 1 (ASAP1), y (ii) ARNm Tol2, del congelador a -80 °C, y colóquela en hielo.
3. Tire de los divisores en los tanques de cría de peces y permita que los peces se apareen. En general, los peces ponen huevos dentro de los 20-30 minutos posteriores a sacar el divisor. De lo contrario, espere de 1 a 2 horas más. Es posible que algunos peces no pongan huevos. En este caso, repita este experimento para la recolección de embriones de peces.
4. Mientras espera, asegúrese de que haya agujas preparadas con la punta rota en ángulo creando un borde biselado con pinzas, o rompiéndolas en un limpiador de tareas delicadas.
   1. Extraiga las agujas del vidrio capilar en un extractor de micropipetas utilizando los siguientes parámetros: calor 545; tracción 60; velocidad 80; tiempo 250; presión 500. Rompa la aguja con pinzas debajo de un visor de disección (con regla de ocular para estimar el diámetro) sosteniendo las pinzas en un ángulo de aproximadamente 45°. Los diámetros de aguja deseados pueden variar dependiendo de la configuración del microinyector, pero se prefiere un diámetro más pequeño para disminuir la mortalidad embrionaria.
5. Una vez que los peces hayan puesto huevos, recójalos en una placa de Petri de 10 cm de diámetro y llévelos al visor de disección. Retire todos los embriones anormales y los desechos de los peces.
6. Pipetear los embriones fertilizados en el molde de inyección de agarosa al 3% preparado. Retire el exceso de agua para ayudar a mantener los embriones en su lugar.
7. Una vez que todas las filas estén llenas de embriones viables, colóquelas de modo que todas las células individuales miren en la misma dirección hacia la aguja, que es aproximadamente un ángulo de 45° horizontalmente. Esto hará que la inyección sea mucho más fácil más adelante.
8. Mientras usa guantes, use una punta de pipeta de carga de 20 μL y retire 5 μL de la construcción preparada del tubo en hielo.
9. Inserte con cuidado la punta en el extremo posterior del tubo capilar roto hasta donde comienza a golpearse, para que el reactivo esté lo más cerca posible de la punta. Si todavía hay burbujas de aire, agite la aguja, asegurándose de no romper la punta.
10. Inserte la aguja directamente en el soporte de la aguja de microinyección y apriétela con cuidado hasta que la aguja permanezca en su lugar. Ajuste el ángulo a unos 45°.
11. Una vez que la aguja esté preparada y colocada, encienda el microscopio y el tanque de presión de gas. Los tanques comerciales de_CO2 son generalmente buenos para este propósito. El volumen de inyección se ajusta mediante la presión de retención y expulsión: aproximadamente 0,5 psi para la retención y 30 psi para la expulsión. Asegúrese de comprobar que la solución sale al pisar el pedal.
12. Usando un micrómetro de etapa con una gota de aceite mineral, ajuste el volumen y el flujo de la solución a ~ 150 μm de diámetro (aproximadamente 2 nL). Asegúrese de que la contrapresión deje que una pequeña cantidad gotee de la aguja. Si no hay suficiente contrapresión, la acción capilar hará que el líquido entre en la aguja y destruya el ARNm.
13. Una vez que la aguja esté calibrada, comience a inyectar la construcción en la célula individual de los embriones fertilizados><. nota: Esto requiere una gran cantidad de práctica, paciencia y delicadeza, debido a que la membrana celular es difícil de perforar. Es importante inyectar la solución en la célula, no en la yema, para generar pez cebra transgénico. Esto es diferente de la inyección de morfolino. No importa de qué lado ingrese la aguja a la célula, siempre y cuando la construcción vaya dentro de la célula. La transgénesis tendrá una tasa de éxito muy baja si se inyecta en la yema en lugar de en la célula. También es importante la inyección en una sola célula, o se crearán peces quimera somáticos. Esto reducirá la posibilidad de que el transgén entre en las células germinales.
14. Use el borde de la muesca de gel para proporcionar un respaldo que mantenga el embrión en su lugar y permita que la aguja aplique presión sin mover el embrión. Una vez que la punta de la aguja esté en la celda individual, presione el pedal para liberar la cantidad deseada de solución. Repite este proceso para todos los embriones.
15. Una vez finalizado, transfiera los embriones inyectados a un plato etiquetado enjuagándolos de la muesca de agarosa con agua del sistema fish y una pipeta de transferencia desechable de 3,4 ml. Almacene los embriones en una incubadora a 28,5 °C para que se desarrollen.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa RA	Amresco	N605-500G	Para la fabricación de los geles inyectables
Osciloscopio de disección de campo claro	Nikon	SMZ 745	Decorionación, microinyección, montaje
Pipeta de transferencia desechable 3,4 ml	Termo Científico	13-711-9AM	Embriones de peces y transferencia de agua
Pinzas #5	WPI (en inglés	500342	Decorionación y rotura de agujas
Sugerencia de carga	Eppendorf	930001007	Para cargar la solución inyectable en agujas capilares
Molde de microinyección	Herramientas de ciencia adaptativa	AT-1	Para preparar una bandeja de molde de agaorse para contener embriones de pescado durante la inyección
Microinyector	WPI (en inglés	Picobomba neumática PV820	Inyector de microinyección
Micro-manipulador	WPI (en inglés	Microinyector MM3301R	Operación de microinyección
Extractor de micropipetas	Instrumento Sutter	P-1000	Para la preparación de la aguja capilar
Aceite mineral	Amresco	J217-500ml	Para calibrar el volumen de inyección
Placas de Petri de plástico	VWR	25384-088	Para sujetar peces o embriones de peces durante el proceso de obtención de imágenes
Micrómetro de etapa	Am Alcance	MR100	Calibración del volumen de microinyección
Capilares de vidrio de pared delgada	WPI (en inglés	TW100F-4	Vidrio en bruto para hacer aguja cappilar

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