Edición génica mediada por transposones PiggyBac en iPSC humanas: un procedimiento para integrar genes de interés en iPSC humanas utilizando el sistema de transposones PiggyBac

Resumen

Fuente: Garone, M. G. et al. Conversión de Células Madre Pluripotentes Inducidas (iPSCs) Humanas en Neuronas Motoras Espinales y Craneales Funcionales Utilizando Vectores PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra el procedimiento para generar neuronas motoras mediante la transfección de iPSCs humanas con el sistema de transposones PiggyBac mediante la expresión ectópica de factores de transcripción específicos del linaje.

Protocolo

1. Generación de líneas iPSC inducibles NIL y NIP

1. Transfección celular
   1. Enjuague las células con PBS (libre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Añadir reactivo de disociación celular (ver Tabla de Materiales) (0,35 mL para una placa de 35 mm) e incubar a 37 °C hasta que las células individuales estén
   3. separados (5-10 min).
   4. Separación celular completa suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 3-4 veces.
   5. Recoger en un tubo de 15 mL y añadir PBS (Ca^2+/Mg²⁺ libre) a 10 mL. Cuenta las celdas.
   6. Pellet 10⁶ celdas y resuspender en 100 μl de Buffer R (incluido en el kit de electroporación de celdas, ver Tabla de Materiales).
   7. Añadir ADN plasmídico para la transfección: 4,5 μg de vector transponible (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP) y 0,5 μg del plásmido transposasa piggyBac.
   8. Transfectar con el sistema de electroporación de celdas (ver Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los siguientes parámetros: voltaje de 1.200 V, ancho de 30 ms, 1 pulso. Siembre las células en medio iPSC humano suplementado con 10 μM de Y-27632 (inhibidor de ROCK, ver Tabla de Materiales) en un plato recubierto de matriz de 6 mm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplemento sin suero para el mantenimiento de las células neuronales
Bambanker	Genética Nippon	NGE-BB02	Medio de congelación celular para progenitores de neuronas motoras
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Matriz con calificación hESC de Corning Matrigel	Corning	354277	Preparación de la membrana basal reconstituida del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Se utiliza para la adhesión de iPSC a soportes de plástico y vidrio
MEDIOS DE CONGELACIÓN CRYOSTEM ACF	Industrias Biológicas	05-710-1E	Medio de congelación para iPSCs humanas
Dispasa	Gibco	17105-041	Reactivo para la disociación suave de iPSCs humanas
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Medio basal para cultivo celular
doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Se utiliza para inducir la expresión de transgenes de los vectores epB-Bsd-TT-NIL y epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell (Célula Inalámbrica	UWWC1-DS2U	Línea comercial de iPSC para humanos
GDNF (en	PreproTech	450-10	Factor neurotrófico derivado de la glía
Línea gibco episomal hiPSC	Thermo Fisher Scientific	A18945	Línea comercial de iPSC para humanos
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Aminoácidos no esenciales. Se utiliza como suplemento para el medio de cultivo celular, para aumentar el crecimiento y la viabilidad celular.
Kit Neon 100 μL	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Kit de electroporación de celdas
Sistema de transfección de neón	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Sistema de electroporación de celdas
Medio Neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Medio basal diseñado para el mantenimiento y maduración a largo plazo de las poblaciones de células neuronales sin necesidad de una capa alimentadora de astrocitos
NutriStem-XF/FF	Industrias Biológicas	05-100-1A	Medio de cultivo de iPSC humano
Libre de PBS Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Tampón de fosfato salino de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio
Penicilina/Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Solución de penicilina/estreptomicina utilizada para prevenir la contaminación de los cultivos celulares por bacterias.
Y-27632 (inhibidor de ROCK)	Enzo Ciencias de la Vida	ALX-270-333-M005	Inhibidor selectivo permeable a las células de la proteína quinasa (ROCK) que contiene bobina en espiral asociada a Rho. Aumenta la supervivencia de la iPSC

) inglés)