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1. Diseño de ARNg para el vector concatemero CRISPR
>NOTA: El objetivo de esta sección es explicar cómo optar por la mejor estrategia de segmentación y cómo diseñar ARNg que contengan salientes específicos para el vector concatemero CRISPR.
- Diseñe ARNg contra los genes de interés utilizando una herramienta de diseño de ARNg CRISPR de su elección. Consulte la Tabla de Materiales para ver un ejemplo.
nota: Cuando se dirige a un par de genes parálogos, aunque es posible diseñar un gRNA por gen, es recomendable diseñar dos gRNAs por gen para aumentar las posibilidades de lograr un doble knockout (Figura 1).
- Asegúrese de que los ARNg no contengan el sitio de reconocimiento BbsI mediante el uso de una herramienta de mapeo de restricciones (consulte la Tabla de materiales para ver un ejemplo).
- Agregue salientes específicos de vectores de concatemero CRISPR a cada oligonucleótido, como se muestra en la Tabla 1.
>2. Clonación de ARNg en el vector concatemero CRISPR
- Fosforilación y recocido de oligos
nota: Este paso ilustra cómo recocer las hebras superior e inferior de cada oligonucleótido de ARNg y cómo fosforilar sus extremos en una sola reacción.
- Prepare la mezcla de reacción para fosforilar oligonucleótidos y recocer hebras superiores e inferiores en hielo, según las instrucciones a continuación.
nota: Todos los oligonucleótidos se pueden agrupar en una sola reacción; por ejemplo, en el caso de un vector concatemero de 4 gRNA, agrupe 8 oligonucleótidos.
- Para 3 concatemeros, utilice 3,0 μL de hebra superior de ARNg (1,0 μL de cada ARNg; 10 μM, 1 μL/ARNg), 3,0 μL de hebra inferior de ARNg (1,0 μL de cada ARNg; 10 μM, 1 μL/ARNg), 2,0 μL de tampón de ADN ligasa T4 (10x), 1,0 μL de T4 PNK y agregue H2O hasta un volumen total de 20,0 μL.
- Mezcle bien pipeteando y haga funcionar esto en un termociclador con los siguientes ajustes: 37 °C durante 30 min, 95 °C durante 5 min, bajar a 25 °C a 0,3 °C/min, mantener a 4 °C.
- BbsI arrastrando los pies reacción
nota: En esta sección, los oligonucleótidos de ARNg pre-recocidos se incorporan a la posición apropiada del vector concatemero en un solo paso mediante ciclos alternos de digestión y ligadura.
- Diluir la mezcla de reacción 1:100 en agua sin DNasa/RNasa para generar vectores concatemeros de 3 y 4 gRNA.
nota: Al clonar 2 concatemeros de ARNg, este paso no es necesario.
- Ensamble la reacción de barajado de BbsI en hielo, según las instrucciones a continuación. Incluya un control negativo que solo contenga el vector.
- Utilice 100 ng de vector de concatemero CRISPR, 10,0 μL de mezcla de oligonucleótidos, 1,0 μL de tampón de enzima de restricción que contiene BSA (10x), 1,0 μL de DTT (10 mM), 1,0 μL de ATP (10 mM), 1,0 μL de BbsI, 1,0 μL de ligasa T7 y H2O hasta un volumen total de 20,0 μL.
- Mezcle bien pipeteando y ejecute esto en un termociclador con los siguientes ajustes: Ejecute 50 ciclos para clonar 3 y 4 concatemeros de ARNg y 25 ciclos para concatemeros de ARNg de 2, ambos a 37 °C durante 5 minutos, 21 °C durante 5 minutos, manténgalo a 37 °C durante 15 minutos y luego a 4 °C para siempre.
- Tratamiento con exonucleasas
nota: Este paso es muy recomendable, ya que aumenta la eficiencia de la clonación al eliminar cualquier rastro de ADN linealizado.
- Trate la reacción de mezcla BbsI con una exonucleasa de ADN (ver Tabla de Materiales) de la siguiente manera.
- Tome 11,0 μL de mezcla de ligadura del paso anterior (2.2.3), agregue 1,5 μL de tampón de exonucleasa (10x), 1,5 μL de ATP (10 mM), 1,0 μL de ADN exonucleasa y aumente el volumen total a 15,0 μL con agua. Incubar a 37 °C durante 30 min seguido de 70 °C durante 30 min.
nota: Este paso elimina cualquier residuo de ADN linealizado en la mezcla y, por lo tanto, aumenta la eficiencia de la clonación.
- Utilice 2 μL de la mezcla de reacción para la transformación en bacterias E. coli químicamente competentes por choque térmico.
NOTA: Alternativamente, la reacción puede almacenarse hasta una semana a -20 °C.
>3. Transfección de organoides intestinales por electroporación
>NOTA: Tenga en cuenta que este procedimiento se basa en el protocolo publicado por Fujii et al. en 2015, con adaptación para cultivos de organoides del intestino delgado en ratones.
- Pre-electroporación
nota: En esta sección se describe cómo preparar los organoides intestinales del ratón antes de la electroporación mediante la eliminación de todos los antibióticos y medios acondicionados de su medio de cultivo. Esto evitará posibles efectos tóxicos durante la electroporación.
- En el día 0 del procedimiento de transfección, divida los organoides en una proporción de 1:2.
NOTA: Los cultivos de organoides intestinales se pueden obtener realizando el aislamiento de las criptas según los protocolos previamente establecidos. Consulte la Tabla 2 para ver todas las composiciones de medios.
- Al dividir organoides para electroporación, siembre un mínimo de 6 pocillos de una placa de 48 pocillos por transfección.
- Siembre los organoides en gotas de matriz de 20 μL y cultívelos en medio WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-espondina + Nicotinamida) a 37 °C, 5% CO2 en una incubadora humidificada (como se describió anteriormente).
- El día 2, cambie el medio reemplazando WENR+Nic por 250 μL de EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3) + Y-27632 (inhibidor de ROCK), sin antibióticos (ver Tabla 2)
NOTA: En todos los pasos, la cantidad de medio añadido a cada pocillo de una placa de 48 pocillos es de 250 μL.
- El día 3, cambie el medio organoide a EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v Dimetilsulfóxido (DMSO), sin antibióticos.
- Preparación de las células
nota: Aquí describimos cómo fragmentar organoides en pequeños grupos de células mediante disociación mecánica y química. Estos pasos son fundamentales para el éxito del procedimiento.
- El día 4, interrumpa las cúpulas de la matriz basal con una punta de pipeta de 1 mL y transfiera los organoides a un tubo de 1,5 mL. Contenido de la piscina de cuatro pocillos de una placa de 48 pocillos en un tubo.
- Rompa mecánicamente los organoides en pequeños fragmentos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200 aproximadamente 200 veces. Centrífuga a temperatura ambiente, 5 min a 600 x g.
- Retire el medio y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de una proteasa recombinante de grado de cultivo celular (consulte la tabla de materiales). Incubar a 37 °C durante un máximo de 5 min y luego analizar una gota de muestra de 50 μL bajo un microscopio de luz invertida con un objetivo 4x.
nota: Son deseables grupos de 10 a 15 células, ya que esto aumenta la supervivencia celular después de la electroporación.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL de baja unión y detenga la disociación agregando 9 mL de medio basal sin antibióticos (ver Tabla 2). Centrifugar a temperatura ambiente, 5 min a 600 x g, luego desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio sérico reducido (ver Tabla de Materiales).
- Cuente el número de celdas con una cámara de Bürker y use un mínimo de 1 x 105 celdas por reacción de electroporación. Añadir 9 mL de medio sérico reducido al tubo de 15 mL y centrifugar a temperatura ambiente, 3 min a 400 x g.
- Electroporación
nota: Las siguientes secciones proporcionan instrucciones sobre cómo realizar la electroporación y hacer que los organoides se recuperen después.
- Retire todo el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en una solución de electroporación (consulte la tabla de materiales). Agregue una cantidad total de 10 μg de ADN a la suspensión celular y agregue la solución de electroporación hasta un volumen final de 100 μL y mantenga la mezcla de célula y ADN en hielo. Utilice vectores concatámeros CRISPR en combinación con un plásmido de expresión Cas9 (por ejemplo, Addgene #41815) en una proporción de 1:1.
nota: El volumen total del ADN añadido debe ser inferior o igual al 10% del volumen total de la reacción.
- Incluya una mezcla de transfección separada que contenga un plásmido GFP para evaluar la eficiencia de la transfección (p. ej., pCMV-GFP, Addgene #11153 o cualquier plásmido genérico que exprese GFP).
- Agregue la mezcla de célula y ADN a la cubeta de electroporación y colóquela en la cámara del electroporador. Mida la impedancia pulsando el botón correspondiente en el electroporador y asegúrese de que sea de 0,030-0,055 kΩ. Realice la electroporación de acuerdo con la configuración que se muestra en la Tabla 3.
nota: Si el valor de impedancia cae fuera del rango permitido, ajuste el volumen de la solución en la cubeta.
- Agregue 400 μL de tampón de electroporación + Y-27632 a la cubeta y luego transfiera todo a un tubo de 1,5 mL. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min para permitir que las células se recuperen y posteriormente hacerlas girar a temperatura ambiente durante 3 min a 400 x g.
- Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 20 μL/pocillo de matriz basal. Siembre aproximadamente 1 x 104 a 1 x 105 celdas por pocillo en una placa de 48 pocillos y agregue EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v medio DMSO. Incubar a 37 °C.
- En el día 5, cambie el medio a EN + CHIR99021 + Y-27632 y verifique la eficiencia de la transfección observando la expresión de GFP (Figura 2). Mantenga los organoides a 37 °C y refresque EN + CHIR99021 + Y-27632 medio después de 2 días.
- El día 9, cambie el medio a WENR + Nic + Y-27632 e incube a 37 °C.
nota: Y-27632 se puede eliminar después de 7-10 días (en los días 16-19).
| Cassette 1 | Cassette 2 | Cassette 3 | Cassette 4 |
| Secuencia (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| Secuencia (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tabla 1: Voladizos para cada casete del vector concatemero CRISPR.
| Medio basal | | Comentarios |
| Almacenar a 4 °C durante 4 semanas | | |
| Medio de cultivo celular | 500 mL | Ver tabla de materiales |
| L-Glutamina | 100x 5 mL | |
| Agente amortiguador 1 M | 5 mL | Ver tabla de materiales |
| Penicilina Estreptomicina | 100x 5 mL | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamida) | | |
| Almacenar a 4 °C durante 2 semanas | | |
| Medio basal | hasta 50 mL | |
| Suplemento sin suero de células neuronales (50x) | 1 mL | Ver tabla de materiales |
| Suplemento sin suero de células neuronales (100x) | 500 μL | Ver tabla de materiales |
| n-acetilcisteína (500 mM) | 125 μL | |
| EGF de ratón (100 μg/mL) | 25 μL | |
| ratón Noggin (100 μg/mL) | 50 μL | |
| Medio acondicionado R-Spondin | 5 mL | |
| Medio acondicionado Wnt3a | 25 mL | |
| Nicotinamida (1 M) | 250 μL | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | | |
| Almacenar a 4 °C durante 2 semanas | | |
| Medio basal sin penicilina Estreptomicina | hasta 20 mL | |
| Suplemento sin suero de células neuronales (50x) | 400 μL | Ver tabla de materiales |
| Suplemento sin suero de células neuronales (100x) | 200 μL | Ver tabla de materiales |
| n-acetilcisteína (500 mM) | 50 μL | |
| EGF de ratón (100 μg/mL) | 10 μL | |
| ratón Noggin (100 μg/mL) | 20 μL | |
| Y-27632 (10 μM) | 20 μL | |
| CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
| EN (EGF + Noggin) | | |
| Almacenar a 4 °C durante 4 semanas | | |
| Medio basal | hasta 50 mL | |
| Suplemento sin suero de células neuronales (50x) | 1 mL | Ver Tabla de materiales |
| Suplemento sin suero de células neuronales (100x) | 500 μL | Ver Tabla de materiales |
| n-acetilcisteína (500 mM) | 125 μL | |
| EGF de ratón (100 μg/mL) | 25 μL | |
| ratón Noggin (100 μg/mL) | 50 μL | |
Tabla 2: Composición de medios organoides.
| Pulso de poro | Pulso de transferencia |
| voltaje | 175V | 20V |
| Longitud del pulso | 5 mseg | 50 mseg |
| Intervalo de pulso | 50 mseg | 50 mseg |
| Número de pulsos | número arábigo | 5 |
| Tasa de decaimiento | 10% | 40% |
| polaridad | + | +/- |
Tabla 3: Ajustes de electroporación.
