Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Instalación de software
- Siga las instrucciones para instalar el software desde https://github.com/bsbrl/Autoinjector.
>2. Preparación de reactivos y pipetas
- Agarosa: Prepare agarosa al 3% disolviendo por separado 3 g de agarosa de amplio espectro y 3 g de agarosa de bajo punto de fusión en 100 mL de PBS de grado de cultivo celular en dos botellas de vidrio separadas de 200 mL, respectivamente. Almacene a temperatura ambiente hasta por 3 meses.
- Solución Tyrode: Disolver 1 g de bicarbonato sódico y sal Tyrode (utilizar todo el contenido del frasco) y 13 mL de 1 M HEPES en 1 L de agua destilada. Ajusta el pH a 7,4. Filtre la solución a través de un filtro de tapa de botella de 0,2 μm.
- Medio de cultivo en rodajas (SCM): Agregue 10 mL de suero de rata, 1 mL de 2 mM de glutamina, 1 mL de penicilina-estreptomicina (100x), 1 mL de suplemento de N-2 (100x), 2 mL de suplemento de B27 (50x) y 1 mL de tampón HEPES (pH 7.3) en 84 mL de medio Neurobasal. Alícuota 5 mL de SCM en tubos de 15 mL. Conservar a -20 °C.
- Medio de microinyección independiente de CO2 (CIMM): Prepare 5 soluciones bajas en glucosa modificadas con DMEM (sin rojo de fenol) disolviendo el polvo en 200 ml de agua destilada. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 μm en la parte superior de la botella (para el polvo DMEM, use el contenido de toda la botella). Para preparar 100 mL de CIMM, mezcle 20 mL de solución modificada con DMEM 5x, 1 mL de tampón HEPES, 1 mL de suplemento de N2 (100x), 2 mL de suplemento de B27 (50x), 1 mL de penicilina-estreptomicina (100x), 1 mL de 2 mM de glutamina y 74 mL de agua destilada. Almacene la solución a 4 °C.
- Tampón de reconstitución: Prepare el tampón de reconstitución disolviendo 262 mM de NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES en agua destilada. Esterilice la solución mediante filtración a través de un sistema de filtro de 0,22 μm en la parte superior de una botella de vidrio estéril. Alícuota 500 μL de tampón de reconstitución en tubos de microcentrífuga herméticos. Conservar a 4 °C.
- Colorante por microinyección: Disolver el dextrano marcado con fluorescencia en agua destilada libre de ARNasa (concentración final 10 μg/μL). Prepare 5 μL de alícuotas y almacene a -20 °C hasta su uso.
- Extraiga las pipetas de microinyección de los capilares de vidrio de borosilicato (1,2 mm de diámetro exterior, 0,94 mm de diámetro interior) con el extractor de micropipetas. Proteja las pipetas del polvo. No almacene las pipetas durante más de 2 o 3 días. Para este experimento, los parámetros de tracción fueron HEAT: temperatura de rampa +1 – 5; TIRÓN: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT y VEL son los parámetros que más afectan a la forma y al tamaño de la pipeta.
nota: La pipeta de microinyección óptima tiene una punta larga y flexible, para evitar el daño celular durante la microinyección.
>3. Preparación de cortes de tejido
- Derrita la agarosa de amplio rango al 3% usando un horno de microondas antes de la disección del tejido cerebral. No permita que la agarosa se solidifique manteniéndola en un baño de agua a 37 °C antes de incrustarla. Asegúrese de que las pipetas estén protegidas del polvo. No almacene las pipetas durante más de 2 o 3 días.
- Descongele una alícuota de SCM y caliente 10-12 mL de CIMM y 20 mL de solución de Tyrode a 37 °C usando un baño de agua.
- Mezcle el trazador fluorescente (Dextran-3000 o Dextran-10000-Alexa conjugado; concentración final de 5 a 10 μg/μL) con los otros productos químicos que se van a inyectar. Centrifugar la solución de microinyección a 16.000 x g durante 30 min a 4 °C. Recoger el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo. Mantenga la solución de microinyección en hielo hasta su uso.
- Utilice las cabezas de embriones de ratón E13.5–E16.5 para preparar cortes de tejido organotípico del telencéfalo. Retire la piel y abra el cráneo con las pinzas, moviéndose a lo largo de la línea media. Diseccionar el cerebro embrionario del cráneo abierto y extirpar las meninges que cubren el tejido cerebral comenzando desde el lado ventral del cerebro. Deje el cerebro entero diseccionado en la solución de Tyrode en un bloque de calentamiento a 37 °C.
nota: Todos los pasos de disección descritos en 3.4 deben realizarse en solución de Tyrode precalentada.
- Vierta la amplia gama de agarosa derretida en un molde de inclusión desechable. Cuando la agarosa se enfríe a 38-39 °C, transfiera con cuidado los sesos (un máximo de 4) a ella con una pipeta Pasteur. Utilice siempre puntas de corte para este paso.
- Revuelva la agarosa alrededor del tejido, ya sea con una espátula o un par de pinzas Dumont # 1 sin tocar el tejido. Deje que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente. Una vez que la agarosa se haya solidificado, recorte el exceso de agarosa que rodea el tejido.
- Llene la bandeja intermedia con PBS. Orientar el cerebro con el eje rostro-caudal del tejido perpendicular a la bandeja (utilizar como punto de referencia los bulbos olfativos, que representan la parte más rostral del cerebro). Corta rodajas de 250 μm con un vibrátomo.
- Llene una placa de Petri de 3,5 cm con 2 ml de medio precalentado. Con una pipeta Pasteur de plástico, transfiera las rodajas (10-15) a este plato. Una vez hecho esto, coloque la placa de Petri con las rodajas en la incubadora de cultivo de rebanadas. Mantener las lonchas a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 40% de O2 / 5% de CO2 / 55% de N2 hasta su uso.
4. Microinyección
- Encienda la computadora, el microscopio, la cámara del microscopio, los manipuladores, la plataforma de presión y el sensor de presión. Cargue la aplicación haciendo clic en el archivo "launchapp.py" en la carpeta principal descargada de GitHub y especifique la configuración del dispositivo en la pantalla emergente (consulte el paso 1.1 para obtener instrucciones de instalación).
- Cree una presión hacia afuera para evitar obstrucciones no deseadas antes de sumergir la pipeta en la solución. Para aplicar presión a la pipeta, deslice la barra de presión de compensación hasta el 24-45 % y haga clic en Establecer valores. A continuación, ajuste la presión a una presión suficiente girando la perilla de la válvula de presión mecánica a 1-2 PSI (69-138 mbar) según lo indicado por el sensor de presión.
- Transfiera las rodajas a una placa de Petri de 3,5 cm que contenga 2 ml de CIMM precalentado. Coloque las rodajas a microinyectar en el centro de la placa de Petri. Transfiera la placa de Petri a la etapa de microinyección precalentada (37 °C).
- Cargue la pipeta de microinyección con 1,4-1,6 μl de solución microinyectada (a partir del paso 3.3) utilizando una pipeta de plástico de punta larga. Inserte la pipeta de microinyección en el soporte de pipetas.
- Con el aumento más bajo del microscopio, enfoque el corte y guíe la micropipeta a este campo de visión (FOV) para que se enfoque en el mismo plano que el objetivo del corte. Cambie la salida del microscopio a la cámara para ver el campo de visión en la aplicación.
- Haga clic en el botón de ampliación en la parte superior izquierda de la interfaz para iniciar la calibración del dispositivo. Una ventana le pedirá que seleccione la ampliación. Seleccione el aumento de 10x, o cualquier aumento en el que esté configurado el lente (por ejemplo, 4x, 10x, 20x, 40x) y presione Ok. El software asume que la lente del objetivo interno es de 10x (el aumento de la lente del objetivo más común).
- Vuelva a enfocar la punta de pipeta con la rueda micrométrica del microscopio y haga clic en la punta de pipeta con el cursor. A continuación, presione el botón del paso 1.1 y presione OK en la ventana emergente. La pipeta se moverá en la dirección Y. Haga clic en la punta de la pipeta y pulse el botón del paso 1.2. Por último, introduzca 45 en el cuadro de ángulo de la pipeta y pulse el botón Establecer ángulo.
- Introduzca los parámetros deseados en el panel de controles de microinyección automatizada. Para la microinyección en progenitores apicales, establezca la distancia de inyección en 20-40 μm y la profundidad en 10-15 μm. Para la microinyección en las neuronas, establezca la distancia de inyección de 30 a 40 μm desde el lado basal y la profundidad a 10 a 30 μm, dependiendo de lo que se esté buscando. Ajuste siempre la velocidad al 100%. Haga clic en Establecer valores.
nota: La distancia de aproximación es la distancia a la que la pipeta extrae del tejido antes de pasar a la siguiente distancia de inyección, la profundidad es la profundidad en el tejido por la que llega la microinyección, el espaciado es la distancia a lo largo de la línea entre inyecciones secuenciales, la velocidad es la velocidad de la pipeta en μm/s.
- Haga clic en el botón Dibujar borde y arrastre el cursor a lo largo de la trayectoria deseada en la ventana emergente para definir la trayectoria de la inyección. Para la microinyección de células madre progenitoras, se dirige el lado ventral de la superficie del telencéfalo. Lleve la pipeta al inicio de la línea y haga clic en la punta de la pipeta. Haga clic en Ejecutar trayectoria para iniciar la microinyección. Repita este paso para cada plano de inyección objetivo (generalmente se hace para 3 a 4 planos con 40 a 75 inyecciones por avión).
