Purificación de proteínas basada en cromatografía de intercambio aniónico: una técnica de separación para aislar una proteína de interés del lisado bacteriano dializado basada en la carga neta

Resumen

Fuente: Fuehner, S., et al. Purificación de S100A12 humano y sus oligómeros inducidos por iones para la estimulación de células inmunitarias J. vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos una técnica de cromatografía de intercambio aniónico para purificar la S100A12 de proteínas de unión al calcio humano basada en la carga superficial neta de la proteína de un cultivo de Escherichia coli.

Protocolo

1. Purificación de proteínas

1. Cromatografía de intercambio aniónico
   1. diálisis
      1. Prepare el tampón A de cromatografía de intercambio aniónico (AIEX) disolviendo 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA y 1 mM de etilenglicol-bis(2-aminoetilo)-N, N, N', N'-ácido tetraacético (EGTA) en agua desionizada y ajuste el pH a 8,5 con HCl. Para diálisis, prepare 2 x 5 L y para cromatografía 2 x 1 L de tampón AIEX A.
         nota: El volumen de dializado debe ser de aproximadamente 100 veces el volumen de la muestra. Todos los tampones utilizados para la cromatografía deben filtrarse (0,45 μm o menos) y desgasificarse (por ejemplo, mediante baño ultrasónico o desgasificación al vacío).
      2. Corte el tubo de diálisis (corte de peso molecular [MWCO]: 3,5 kDa) en una longitud adecuada con espacio adicional para el aire a fin de garantizar la flotabilidad de la muestra por encima de la barra de agitación giratoria.
         nota: El glicerol preserva la membrana y debe eliminarse antes de su uso.
      3. Para reducir la viscosidad de la solución proteica aclarada, diluya la solución con 25 mL de tampón AIEX A para facilitar la aplicación posterior a la columna de cromatografía. Coloque el primer cierre en el tubo, cargue la muestra en la membrana y coloque el segundo cierre al menos a 1 cm del extremo superior del tubo.
      4. Coloque el recipiente de 5 L con tampón AIEX A en una placa de agitación, agregue una barra de agitación y la membrana llena de solución de proteínas. Ajuste la velocidad para rotar la muestra evitando interferencias con la barra agitadora giratoria. Diálisis durante 12-24 h a 4 °C, luego reemplace el tampón de dializado (tampón AIEX A) por una nueva preparación preenfriada y continúe durante al menos 4 horas adicionales. Transfiera la solución de proteína dializada a un tubo de 50 mL y filtre a través de una unidad de filtro de 0,45 μm.
         nota: Posibilidad de almacenamiento.
   2. cromatografía
      1. Ponga en marcha el sistema de cromatografía líquida (FPLC) con mantenimiento general, conecte los tampones de columna AIEX A y AIEX B (tampón AIEX A con 1 M de NaCl) y la columna que contiene la resina de intercambio aniónico. Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros cromatográficos generales.
         nota: Los tampones, la columna y el equipo de FPLC deben equilibrarse a la misma temperatura antes de iniciar la ejecución (consulte los parámetros cromatográficos en la Tabla 1, Tabla 2).
      2. Equilibrar la columna con el tampón AIEX A, cargar posteriormente la muestra en la columna y eluir las proteínas con un gradiente lineal de 0% a 100% de tampón alto en sal (AIEX B). Consulte la Tabla 2 para obtener un protocolo de método detallado.
      3. Recoja fracciones de 2 mL durante la elución y analice 10 μL de cada fracción en una electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 15% teñida con Coomassie (SDS-PAGE). Agrupar las fracciones que contienen S100A12 proteína para diálisis.
         nota: El peso molecular de S100A12 es de 10.575 Da.

Resultados

Tabla 1: Información detallada sobre los parámetros aplicados de la cromatografía de intercambio aniónico.

. ...

Volumen de la cama (CV)	75 mL
monitor	Absorbancia a 280 nM
Presión máx	3 bar
Búfer de columna A	20 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, pH 8,5

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
25% HCl	Carl Roth	X897.1
4&menos; 20% Geles de Proteína Mini-PROTEAN TGX	BioRad	4561093
Coomassie Briliant Blue R250 Solución Decolorante	BioRad	1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Solución de tinción	BioRad	1610436
Sal disódica EDTA dihidratada	Carl Roth	8043.1
EGTA	Carl Roth	3054.3
Q Sepharose Fast Flow	GE Cuidado de la salud	17-0510-01	Resina para cromatografía de intercambio aniónico
Cloruro de sodio (NaCl)	Carl Roth	3957.2
Hidróxido de sodio	Carl Roth	P031.1
Tris Base	Carl Roth	4855.3
0.45 µ Filtro de jeringa M	Merck	SLHA033SS
5 L vaso de medición	Carl Roth	CKN3.1
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL	Corning	430829
Cierres de tubos de diálisis	Espectro	132738
Tubos colectores de fracciones 5 mL	Greiner	115101
Spectra/Por Membrana de diálisis (3.5 kDa)	Spectrum	132724
Unidad de filtro Steritop	Merck	SCGPT01RE
Ä Purificador KTA UPC 10	GE Cuidado de la salud		Sistema FPLC
Colector de fracciones	GE Cuidado de la salud	Frac-920
Mini Tetra Cell Proteico	BioRad	1658000EDU
NanoPhotometer	Implen	P330
Medidor de pH	Knick	765