Cromatografía de interacción hidrofóbica dependiente de calcio: una técnica para purificar proteínas de unión al calcio basada en interacciones hidrofóbicas

Resumen

Fuente: Fuehner, S., et al., Purificación de S100A12 humano y sus oligómeros inducidos por iones para la estimulación de células inmunitarias. J. Vis. Exp. (2019).

En este video, demostramos la purificación de la proteína de unión al calcio de un lisado celular dializado mediante cromatografía de interacción hidrofóbica dependiente del calcio. Las proteínas de unión al calcio exponen una región hidrofóbica al unirse con el calcio, lo que facilita la interacción con un grupo hidrofóbico en la resina. Posteriormente, estas proteínas se eluyen utilizando el quelante de calcio EDTA que revierte la interacción.

Protocolo

1. Cromatografía de interacción hidrofóbica dependiente de calcio (HIC)

1. diálisis
   1. Diálisis de la solución proteica frente a 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl, pH 7,5
2. cromatografía
   1. Prepare 1 L de tampón de cromatografía HIC A disolviendo 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl y 25 mM de CaCl2 en agua desionizada y ajuste el pH a 7,5. Para el tampón HIC B, disuelva 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl y 50 mM de EDTA. Ajuste el pH a 7.0 y filtre y desgasifique los tampones. Añadir CaCl2 a la muestra hasta una concentración final de 25 mM y filtrar a través de 0,45 μm. Equilibre los tampones HIC y la muestra a 4 °C (temperatura de la columna).
   2. Inicie el sistema de cromatografía líquida con mantenimiento general, conecte los tampones de columna HIC A y B y la columna. Consulte la Tabla 1 para obtener más parámetros cromatográficos.
   3. Equilibre la columna, cargue la muestra y extienda el bloque de "lavado de muestra no unida" hasta que la señal UV vuelva a alcanzar el nivel de referencia. A continuación, inicie la elución con un quelante de calcio que contenga tampón (EDTA). Consulte la Tabla 2 para obtener un protocolo de método detallado.
      nota: Experimentos anteriores han demostrado que un exceso de calcio parece ser beneficioso para la unión de S100A12 a la resina de cromatografía.
   4. Recoja fracciones pico de 2 mL y analice 10 μL de cada fracción en una SDS-PAGE al 15% teñida con Coomassie. Agrupe fracciones de S100A12 pura y dialice contra solución salina tamponada con Hepes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0).
      nota: El coeficiente de extinción del S100A12 monomérico es de 2980 M-1 cm-1.

Resultados

Tabla 1: Información detallada sobre los parámetros aplicados de la cromatografía de interacción hidrofóbica.

Bloquear	volumen	búfer	salida
Equilibrado	1−2 volúmenes de columna (CV)	un	desperdiciar

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
químico
Sal disódica EDTA dihidratada	Carl Roth	Artículo 8043.1
Fenil Sepharose de alto rendimiento	GE Cuidado de la Salud	17-1082-01	Resina para cromatografía de interacción hidrofóbica
Cloruro de sodio (NaCl)	Carl Roth	3957.2
hidróxido sódico	Carl Roth	P031.1
Base Tris	Carl Roth	4855.3
25% HCl	Carl Roth	X897.1
Cloruro de calcio dihidrato	Carl Roth	Artículo 5239.1
Material de laboratorio
Filtro de jeringa de 0,45 μm	Merck	SLHA033SS
Tubos de fondo redondo de 14 mL	Bd	352059
Matraz Erlenmyer de 2 L	Carl Roth	LY98.1
Tubos colectores de fracciones 5 mL	Greiner	115101
Membrana de diálisis Spectra/Por (3,5 kDa)	espectro	132724
Unidad de filtrado Steritop	Merck	SCGPT01RE
equipo
Colector de fracciones	GE Cuidado de la Salud	Frac-920