Purificación de proteínas basada en cromatografía de afinidad de níquel: una técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas con polihistidina a partir de lisado de células bacterianas

Resumen

Fuente: Pokhrel, A. et al. Un Ensayo de purificación y actividad in vitro para una (p)ppGpp sintetasa de Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, demostramos la técnica de cromatografía de afinidad de níquel para purificar enzimas pirofosfoquinasas marcadas con histidina de la bacteria Clostridium difficile.

Protocolo

1. Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad de níquel

1. Purifique la proteína utilizando 1 mL de resina de ácido níquel-nitriloacético (Ni-NTA) en una columna de gravedad.
   1. El día antes de su uso, equilibrar la columna durante la noche a 4 °C con 2 mL de tampón de equilibrio (10 mM de Tris-HCl pH 7,79, 300 mM de NaCl, 50 mM de NaH₂PO₄, 0,5 mg/mL de lisozima, 5 mM de MgCl₂, 10 mM de imidazol, 0,25 mM de DTT, 5 mM de fluoruro de fenilmetano sulfonilo (PMSF), 10% de glicerol).
   2. Al día siguiente, lleve la columna de 4 °C a RT antes de cargar el lisado clarificado y déjela reposar durante ~2-3 h.
      nota: Llevar la columna al equilibrio térmico es crucial para evitar que se formen burbujas de aire dentro de la columna.
   3. Vuelva a suspender el pellet en el tampón de lisis (10 mM de Tris-HCl pH 7,8, 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl₂, 50 mM de NaH₂PO₄, 10% de glicerol, 0,5 mg/mL de lisozima, 10 mM de imidazol, 0,25 mM de DTT y 5 mM de PMSF).
   4. Sonicar células en hielo durante intervalos de 8 x 10 s, haciendo una pausa de 30 s entre pulsos.
   5. Clarificar el lisado por centrifugación a 3.080 x g durante 30 min a 4 °C utilizando una microcentrífuga.
   6. Prepare el lisado con volúmenes iguales de tampón de lisis, luego aplique el lisado clarificado preparado a la columna y recoja el flujo.
   7. Vuelva a aplicar el flujo de lisado clarificado a la columna y recoja el flujo secundario.
   8. Lavar la columna con tampón de lavado 1 (10 mM de Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl₂, 50 mM de NaH₂PO₄, 30 mM de imidazol, 10% de glicerol). Recopile el flow-through.
      NOTA: La inclusión de 5 mM de MgCl₂ en los tampones de lavado y elución es importante para la actividad enzimática de la proteína purificada.
   9. Lavar la columna con tampón de lavado 2 (10 mM de Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl₂, 50 mM de NaH₂PO₄ y 50 mM de imidazol).
   10. Recoja el flujo continuo.
   11. Aplicar 2 mL de tampón de elución (10 mM de Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 50 mM de NaH₂PO₄, 10% de glicerol y 75 mM de imidazol). Recoja el flujo en dos fracciones de 1 mL cada una.
       nota: La columna después de este paso puede almacenarse en tampón de equilibrio a 4 °C si la misma proteína se purifica en el siguiente ensayo de purificación. La columna se puede utilizar hasta 3 veces si se almacena correctamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Resina Ni-NTA	G Biociencias	786-940/941
Columnas de gravedad desechables Pierce, 10 mL	Termo Científico	29924
Dispositivo de diálisis Spectra/ Por float-A-lyzer G2 de 1 mL (MWCO: 20 kD)	espectro	G235033
Procesador ultrasónico	Sonics	VC-750
Microcentrífuga con rotor D3024/D3024R	Scilogex