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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Extracción del total de lípidos no covalentes ligados de micobacterias (Figura 1)
- Raye 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y añádalo a un tubo de vidrio con tapones de rosca de revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE). Agregue una solución compuesta por 5 mL de cloroformo y 10 mL de metanol (cloroformo:metanol, 1:2).
nota: Cuando se utilizan disolventes orgánicos, sólo se debe utilizar un recipiente de vidrio. No se permiten envases de plástico. Además, se necesitan tapones de rosca de revestimiento de PTFE para botellas.
cautela: El cloroformo es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El metanol es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
- Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer los lípidos no covalentes de la superficie de la célula micobacteriana.
nota: Si no se dispone de una plataforma de agitación orbital, la agitación constante puede sustituirse por una agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible.
- Cubra un embudo de vidrio con un papel de filtro, filtre los solventes orgánicos y recójalos en un tubo de vidrio.
- Utilice un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, cúbralo y guárdelo a 4 °C.
nota: Conecte una pipeta Pasteur de vidrio a la corriente de gas nitrógeno para evaporar específicamente el tubo deseado. Además, mantenga el tubo dentro de un calentador de bloque seco para tubos a 37 °C. Cuando el solvente se evapore, llene el tubo con gas nitrógeno antes de cerrarlo.
- Añadir 15 mL de una solución de cloroformo:metanol (2:1) a los restos celulares. Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer los lípidos no covalentes de la superficie de la célula micobacteriana.
nota: Si no se dispone de una plataforma de agitación orbital, la agitación constante puede sustituirse por una agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible.
- Deja reposar la mezcla durante 1 h. Con una pipeta Pasteur, recupere los disolventes orgánicos. Cubra un vertedero de vidrio con un papel de filtro y filtre los solventes orgánicos y recójalos en el mismo tubo de vidrio utilizado anteriormente en el paso 1.3. Utilice un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérrelo y vuelva a guardarlo a 4 °C.
2. Extracción de ácido micólico por metanólisis ácida (Figura 2A)
- Agregue 2-5 mL de solución esterificante en un tubo de vidrio hermético con un tapón de rosca de revestimiento de PTFE. Añadir 0,2 g de biomasa de micobacterias en el tubo de vidrio.
nota: La solución esterificante se forma mezclando 30 mL de metanol, 15 mL de tolueno y 1 mL de ácido sulfúrico. Las células de micobacterias se pueden tomar de cultivos sólidos o, incluso, de células delipidadas después de realizar la extracción de lípidos totales no covalentes de micobacterias (células restantes después del filtrado en el paso 1.6).
cautela: El tolueno es una sustancia inflamable y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El ácido sulfúrico es una sustancia corrosiva y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
- Mezcle el contenido por vórtice. Deje reposar la mezcla dentro de un baño seco a 80 °C durante la noche.
- Deje que el tubo se enfríe hasta que alcance la temperatura ambiente y luego agregue 2 ml de n-hexano al tubo. Mezcle el contenido mediante vórtice durante 30 s y deje que el tubo se asiente hasta que aparezcan dos fases claras.
PRECAUCIÓN: El n-hexano es una sustancia potencialmente inflamable, irritante, dañina para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
- Recuperar la fase superior correspondiente a la fase n-hexano. Transfiérelo a un tubo nuevo.
- Repita el paso 2.3. Recupere de nuevo la fase superior y transfiérala al mismo tubo utilizado en el paso 2.4.
- Evapore el contenido del tubo utilizando un flujo de gas nitrógeno. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérrelo y guárdelo a 4 °C.
3. Extracción de ácido micólico por saponificación y metilación (Figura 2B)
- Raspe 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y añádalo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de PTFE.
- Añadir 2 mL de solución de metanol-benceno (80:20) que contenga un 5% de hidróxido de potasio. Mezclar el contenido por vórtice. Calentar la mezcla durante 3 h a 100 °C.
cautela: El benceno es una sustancia inflamable, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
- Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente. Agregue un 20% de ácido sulfúrico para acidificar las muestras y lograr un pH = 1.
- Añadir 3 mL de éter dietílico. Mezcle suavemente el contenido mediante vórtice.
- Deje que las dos fases se formen asentándose. Recupere la fase de éter dietílico y transfiéralo a un nuevo tubo. Repita el paso de lavado un total de tres veces.
- Lavar el extracto de éter dietílico con 2 mL de agua destilada y transferir la parte superior correspondiente al éter dietílico a un tubo nuevo. Repita el paso de lavado un total de tres veces.
- Añadir 2 g de sulfato de sodio anhidro sobre el extracto de éter dietílico para secarlo.
- Filtra la suspensión. Evapore el contenido utilizando un flujo de gas nitrógeno.
- Para realizar la etapa de metilación, disuelva 3 g de N-nitroso-N-metilurea en una solución preenfriada formada por 45 mL de éter dietílico y 9 mL de 40% de KOH en agua destilada.
cautela: La N-nitroso-N-metilurea es una sustancia tóxica, irritante, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
- Transfiera el sobrenadante (diazometano) a un nuevo matraz enfriado en hielo que contenga gránulos de hidróxido de potasio (aproximadamente 30 g).
nota: Si el sobrenadante no se utiliza inmediatamente, puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 h.
cautela: Los gránulos de hidróxido de potasio son una sustancia irritante y corrosiva. Este material debe utilizarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo)
cautela: El diazometano es altamente tóxico y potencialmente explosivo. Debe usarse en una campana de flujo laminar con vidrio de seguridad y usar el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
- Añadir 2 mL de la solución de éter que contiene diazometano, obtenida en el paso 3.10, en el extracto seco de éter dietílico que contiene ácidos micólicos, obtenido en el paso 3.8. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Evaporar la suspensión a 40 °C. Llenar el tubo con gas nitrógeno, cerrarlo y almacenar los lípidos metilados a 4 °C.
nota: Evapore el diazometano de la solución de éter debajo de la campana de flujo laminar, hasta que el éter pierda el color amarillo.
4. Análisis de cromatografía en capa fina (TLC)
- Satura la cámara de vidrio TLC. Para ello, cubra una de las paredes de la cámara TLC con un trozo de papel de filtro y permita que esté en contacto con la fase móvil compuesta por la mezcla de disolventes. Coloque el volumen restante del solvente en el fondo de la cámara TLC.
nota: El fondo de la cámara TLC debe estar cubierto por al menos 1 cm de la fase móvil. En los experimentos presentes, se utilizaron diferentes fases móviles para desarrollar los TLC. Consistieron en 85 mL de n-hexano más 15 mL de éter dietílico; 100 mL de diclorometano; 90 mL de cloroformo, 10 mL de metanol y 1 mL de agua; 30 mL de cloroformo, más 8 mL de metanol y 1 mL de agua; 60 mL de cloroformo, más 35 mL de metanol, y 8 mL de agua; 95 mL de cloroformo más 5 mL de metanol; y 90 mL de éter de petróleo (60-80 °C) más 10 mL de éter dietílico.
nota: En el TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con tolueno:acetona (97:3) en la segunda dirección para analizar la composición del ácido micólico. Para analizar los PIM, use cloroformo:metanol:agua (60:30:6) en la primera dirección una vez, y use cloroformo:ácido acético:metanol:agua (40:25:3:6) en la segunda dirección. Para analizar PDIM y AG, use éter de petróleo (60-80 °C): acetato de etilo (98: 2) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con éter de petróleo (60-80 ° C): acetona (98: 2) en la segunda dirección><.
cautela: El éter dietílico es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El diclorometano es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El éter de petróleo es una sustancia potencialmente inflamable, dañina para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El ácido acético es una sustancia potencialmente inflamable y corrosiva. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El acetato de etilo es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: La acetona es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
- Cierre la cámara TLC para saturarla durante al menos 20 minutos. Mientras tanto, disuelva los lípidos presentes en el tubo de vidrio en 0,2-1 mL de cloroformo.
nota: El volumen utilizado para disolver los lípidos puede modificarse en función de la concentración deseada o esperada de la muestra.
- Aplique 10 μL de cada suspensión utilizando un tubo de vidrio capilar directamente sobre la placa TLC y deje secar la muestra durante 5 min a temperatura ambiente.
nota: Las muestras deben aplicarse en la parte inferior de la placa dejando 1 cm a cada lado. Las muestras deben estar separadas unas de otras durante al menos 0,5 cm. Una vez que la muestra se aplica en la placa, los tubos se pueden evaporar nuevamente con gas nitrógeno y almacenar a 4 °C para su uso posterior.
- Inserte la placa en la cámara TLC saturada que contiene la fase móvil. Permitir que la fase móvil se ejecute a través de TLC.
nota: Cualquier movimiento aplicado a la cámara TLC afecta al disolvente que corre en la placa y afecta a la movilidad de los lípidos. En el caso de realizar TLC bidimensional, se requieren dos cámaras TLC para contener ambos sistemas de elución.
- Retire la placa de la cámara TLC cuando el disolvente alcance una distancia de 1 cm del extremo superior de la placa. Deje la placa bajo fundente laminar hasta que la sílice esté totalmente seca.
nota: En el caso de analizar la composición del ácido micólico, utilizando n-hexano y dietil-éter (85:15), repetir los pasos 4.4 y 4.5 dos veces más, hasta ejecutar la fase móvil tres veces sobre la placa TLC.
- Revele la placa con la mancha requerida; caliente la placa si es necesario.
nota: En el presente experimento, se utilizaron 15-20 mL de las siguientes soluciones para rociar las placas TLC: 10% de ácido molibdatofosfórico hidratado en etanol hasta que la placa esté de color amarillo brillante, seguido de calentar la placa a 120 °C; 5% en etanol de 20% α-naftol en ácido sulfúrico seguido de calentamiento de la placa a 120 °C; Reactivo de azul de molibdeno (1,3% de óxido de molibdeno en ácido sulfúrico 4,2 M) hasta que aparecieron bandas de fosfato o 1% de antrona en ácido sulfúrico.
cautela: El hidrato de ácido molibdatofosfórico es una sustancia inflamable y corrosiva. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El etanol es una sustancia potencialmente inflamable y peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El 1-naftol es una sustancia inflamable, corrosiva y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
cautela: El reactivo de aerosol azul de molibdeno es una sustancia corrosiva, tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
