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1. Preparación del sistema de cromatografía
- Prepare el sistema de cromatografía enjuagando secuencialmente la muestra y las líneas tampón, cada una con agua estéril, hidróxido de sodio 1 N, agua y tampón de lavado (tampón de fosfato de sodio de 20 mM que contiene cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0) a un caudal lineal de 50 mL/min.
- Prepare una columna de heparina de 50 μm (10 × 10 cm, 7,9 mL de volumen de columna (CV)) mediante la ejecución secuencial de tampón de limpieza de columna (tampón de fosfato sódico estéril de 20 mM de 5 CV que contiene cloruro de sodio 2 M, pH 7,0) y tampón de lavado de 5 CV a un caudal lineal de 7 mL/min.
2. Purificación del vector Baculovirus
- Configure el sistema de cromatografía de la siguiente manera:
- Utilice el puerto de entrada de carga de muestras para cargar el sobrenadante de baculovirus.
- Utilice el puerto de entrada del tampón A1 para cargar el tampón de lavado. Prepare una botella con al menos 500 ml de tampón de lavado y coloque la línea de tampón de lavado en la botella.
- Utilice el puerto de entrada del tampón A2 para cargar el tampón de elución (20 mM de fosfato de sodio con 1,5 M de cloruro de sodio, pH 8,0). Prepare una botella con al menos 500 ml de tampón de elución y coloque la línea de tampón de elución en la botella.
- Inserte varios tubos cónicos de 50 mL en el colector de fracciones para recoger el sobrenadante de baculovirus de paso de columna, el tampón de lavado y el baculovirus eluido.
- Equilibre la columna de heparina con cinco volúmenes de columna (CV) de 7,9 mL de tampón de lavado (40 mL) a un caudal lineal de 7,0 mL/min.
- Cargue 250 mL de sobrenadante de baculovirus en la columna de heparina utilizando la bomba de muestra (puerto de muestra de entrada) del sistema de cromatografía a un caudal lineal de 2,0 mL/min.
- Pase 10 CV (80 mL) de tampón de lavado a través de la columna de heparina a un caudal lineal de 2,0 mL/min hasta que la curva de absorbancia ultravioleta (UV) (280 nm) haya vuelto a la línea de base y se estabilice.
- Eluir las partículas de baculovirus de la columna de heparina de 7,9 mL con 5 CV (40 mL) de tampón de elución a un caudal lineal de 4,0 mL/min. Observe un pico de elución brusco de proteína en el cromatograma cuando las partículas de baculovirus se disocian de la columna de heparina.
- Después de la elución, diluya inmediatamente el sobrenadante de baculovirus eluido 10 veces utilizando un tampón de fosfato de sodio de 20 mM en agua para evitar la inactivación de las partículas de baculovirus por choque osmótico durante la centrifugación posterior.