Cromatografía de intercambio catiónico: una técnica para aislar la proteína recombinante diana del lisado de células de insectos basada en la carga superficial neta

Resumen

Fuente: Agamasu, C. et al. KRAS4b recombinante totalmente procesado: aislando y caracterizando la proteína farnesilada y metilada. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra la técnica de cromatografía de intercambio catiónico para aislar la proteína recombinante del lisado de proteínas de células de insecto.

Protocolo

1. Purificación de proteínas

1. Prepare los tampones de la A a la H, como se ve en la Tabla 1.

solución tampón	Agente amortiguador (todos los 20 mM)	pH	NaCl (mM)	Imidazol (mM)	MgCl2	TCEP
un	HEPES	7.3	300	-	5	1
B	HEPES	7.3	300	35	5	1
C	HEPES	7.3	300	500	5	1
D	MES	6.0	200	-	5	1
E	MES	6.0	-	-	5	1
F	MES	6.0	100	-	5	1
G	MES	6.0	1000	-	5	1
H	HEPES	7.3	300	-	1	1

2. Prepare los materiales de purificación (consulte la tabla de materiales): cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA u otros quelantes; columna de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC); columna de cromatografía de intercambio catiónico (CEX); filtro de jeringa de 0,45 μm; imidazol 2 M (pH = 7,5); ultracentrífuga con capacidad de 100.000 x g; centrífuga de sobremesa de alta velocidad con capacidad de 4.000 x g; unidades de filtro centrífugo (10 KDa NMWL); espectrofotómetro capaz de leer a 280 nm; Proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV); e instrumentación de cromatografía capaz de mezclar dos soluciones tampón, aplicar soluciones a columnas, crear eluciones de gradiente a partir de columnas y recolectar fracciones a partir de columnas.
3. Retire el lisado de células de insectos de la diálisis y centrifugue a 4.000 x g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitado. La muestra final dializada y clarificada en este punto todavía suele ser borrosa, pero se puede aplicar sin más procesamiento en la columna CEX posterior.
4. Prepare una columna de intercambio catiónico de 20 mL (ver Tabla de Materiales) lavando con tres CV de Tampón G, luego con tres CV de Tampón F.
   nota: Si bien no hemos evaluado meticulosamente otras resinas, varios colegas han encontrado una mala resolución con resinas distintas a la resina SP Sepharose High Performance.
5. Diluir 20 mL de la muestra dializada hasta una concentración final de NaCl de 100 mM añadiendo 20 mL de tampón E y aplicar la muestra diluida a la columna de intercambio catiónico.
6. Continúe cargando la columna agregando muestras recién diluidas preparadas como se describió anteriormente al tubo de carga a medida que la dilución anterior se acerca al final de la carga.
   nota: La dilución de toda la muestra a la vez a 100 mM de NaCl ha dado lugar a una pérdida significativa de la proteína objetivo debido a la precipitación.
7. Lave la columna hasta la línea de base Abs280 con Buffer F. Por lo general, esto requiere 3 CV. La proteína se eluye de la columna durante un gradiente de 400 mL (20 CV) desde el tampón F hasta el 65% del tampón G, recogido en fracciones de 6 mL (Figura 1B).
8. Continúe lavando la columna durante 1,5 CV adicionales (65% de tampón G) una vez que se complete el gradiente.

Resultados

Figura 1: Geles SDS-PAGE del proceso de purificación. (A) Captura de IMAC del lisado. FNTA/B son las bandas oscuras que migran a ~48 kDa y His6-MBP-tev-KRAS4b es la banda oscura que migra a ~67 kDa. M = escala de peso molecular de proteínas; T = proteína total; L = carga de lisado/columna clarificada; F = flujo de columna. Las fracciones se eluyen con un gradiente de concentración de imidazol creciente...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos Safe-Lock de 1,8 ml, naturales	Eppendorf	22363204
Viales de muestreador automático con inserto entrelazado Cl SS de 11 mm	Termo Científico	30211SS-1232
Centrífuga 5427R	Eppendor
Acetonitrilo, grado de HPLC	Fisher Chemical	A998-1 1L
Columna de cromatografía de intercambio catiónico (CEX)	GE Healthcare Ciencias de la Vida	29018183	HiPrep SP Sepharose de alto rendimiento
Espectrómetro de masas Exactive Plus EMR	Termo Científico
Viales Gilson 7x14 mm Tubos	GE Cuidado de la Salud	BR-1002-12
Centrífuga de alta velocidad/de sobremesa	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	Capaz de hasta 4.000 xg
His6-Virus del Grabado del Tabaco (TEV) proteasa	Addgene	92414	Purificado según Raran-Kurussi et al. (2017) Eliminación de etiquetas de afinidad con proteasa TEV. En: Burgess Brown N. (eds) Expresión génica heteróloga en E. coli. Métodos en Biología Molecular, vol 1586. Humana Press, Nueva York, NY
Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA u otros quelantes	Millipore Sigma	P8849
Acetato de amonio	Sigma-Aldrich	09689-250g
Gas argón	Gases aéreos	ARUP
ácido fórmico	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Utilice grado de reactivo o superior
Sistema de cromatografía NGC	BioRad	78880002	Sistema de cromatografía NGC QuestTM 100
Juego de extrusoras de lípidos con soporte	LÍPIDOS POLARES AVANTI	610023
nitrógeno líquido	Gases aéreos	NI-DEWAR
Unidades de filtro centrífugo Ultra-15, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	Membrana PES
Filtros centrífugos Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL	Amicon	UFC501024
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima - L80K	Capaz de 100.000 XG
Muchachos	sigma	C3023