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1. Preparación de tampones
- Para preparar el tampón de lavado ELISA, agregue 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl y 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 1 L de agua desionizada (DI). Añadir 500 μL de polisorbato-20. Ajuste el pH a 7.2 usando HCl o NaOH.
- Para preparar el tampón de bloqueo, agregue 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl y 10 g de BSA. Agregue 500 μL de polisorbato-20 a 1 L de agua desionizada. Ajuste el pH a 7.2 usando HCl o NaOH.
- Para preparar el tampón de elución (PBS), agregue 8,01 g de NaCl, 2,7 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4 a 1 L de agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 usando HCl o NaOH.
nota: Se puede hacer una solución 10x de este tampón y diluirla con agua desionizada según sea necesario.
2. Preparación de la muestra OMV
- Cultive células de A. actinomycetemcomitans hasta la fase exponencial tardía (densidad óptica a 600 nm de 0,7). Granular las células centrifugando dos veces a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 μm.
- Concentre el sobrenadante libre de bacterias utilizando filtros de corte de peso molecular de 50 kDa. Ultracentrifugar la solución concentrada a 105.000 x g a 4 °C durante 30 min.
- Vuelva a suspender el pellet en PBS y vuelva a ultracentrífuga (105.000 x g a 4 °C durante 30 min.) Vuelva a suspender el pellet en 2 mL de PBS.
3. Empaquetando la columna S-1000
- Mezcle el frasco de medio de filtración de gel con una varilla de agitación de vidrio y vierta en una botella de vidrio el volumen necesario para llenar la columna, más aproximadamente el 50% de exceso (aproximadamente 135 mL). Deje reposar estas cuentas hasta que se hayan asentado y luego decande el exceso de líquido. Vuelva a suspender las perlas en el tampón de elución, de modo que la solución final sea aproximadamente 70% (en volumen) de gel, 30% de tampón. Desgasificar la solución al vacío.
- Monte la columna de vidrio verticalmente usando un soporte de anillo y llénela con tampón de elución para humedecer las paredes de la columna. Drene el tampón hasta que solo quede aproximadamente 1 cm de tampón en la columna.
- Sin crear burbujas, pipetee con cuidado las perlas en la columna, llenándola hasta la parte superior. Continúe drenando el exceso de tampón durante todo este proceso. Asegúrese de no dejar que las cuentas se asienten por completo antes de agregar cuentas adicionales a la parte superior de la columna. La columna debe empaquetarse a una altura de unos 2 cm por debajo del fondo del depósito de la columna.
4. Carga de la muestra y recogida de fracciones
- Desgasifica el tampón de elución al vacío. Lave la columna con dos volúmenes de columna (180 mL) de tampón de elución.
- Permita que el búfer restante entre completamente en la columna. Una vez que el tampón haya alcanzado la parte superior de la capa de gel, pipetee cuidadosamente una muestra de 2 ml que contenga OMV (a una concentración de lípidos de aproximadamente 100 - 200 nmol / L) en la superficie de las perlas, teniendo cuidado de no alterar ninguna de las perlas en la parte superior de la columna. Permita que la muestra ingrese completamente al gel, es decir, cuando no quede líquido por encima de la capa de gel.
- Agregue con cuidado y lentamente el tampón de elución en la parte superior de la columna de gel. No altere la capa superior del gel, ya que esto provocará la dilución de la muestra.
- Coloque un solo tubo de 50 ml debajo de la columna y abra la columna. Recoja los primeros 20 mL del eluyente. Agregue tampón de elución adicional a la parte superior de la columna, con cuidado, según sea necesario para garantizar que la columna nunca esté seca.
- Coloque una serie de tubos de 1,5 ml debajo de la columna. Comience la columna y recoja una serie de muestras de 1 ml en cada tubo. A medida que se recolectan las muestras, continúe agregando tampón de elución en la parte superior de la columna, según sea necesario. Repita hasta que se hayan recogido 96 fracciones. Detenga la columna.
nota: Las muestras deben almacenarse a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo o a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo hasta el análisis posterior.
- Para limpiar la columna, pase un volumen de columna (90 mL) de 0,1 M de NaOH a través de la columna. Ejecute dos volúmenes de columna (180 ml) de tampón de elución a través de la columna.