1. Producir y caracterizar el anticuerpo
- Expresar el anticuerpo
- Descongele un vial de células en suspensión de HEK en un matraz de 250 ml que contenga 50 ml de medio de expresión suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 250 ng/ml de anfotericina B. Mantenga las células a 37 °C con 8% deCO2 en incubadoras humidificadas equipadas con un agitador a 125 rpm. Divida las células en 0,3-0,5 x 106 células/ml (cada 2-3 días) al menos 2 veces antes de la transfección.
- Cuando se alcance una densidad de 2,5 x 106 células/mL (2-3 días después de la división), prepare una solución fresca de 100 mM CypK. Para ello, pesar 64 mg de CypK, añadir 2,5 mL de hidróxido de sodio 0,1, vórtice, centrifugar para recuperar todas las partículas no disueltas y sonicato.
- Añadir 2,5 mL de CypK (100 mM en 0,1 M de NaOH) a 42,5 mL de medio de expresión suplementado con antibióticos. Mezclar bien, añadir 250 μL de HCl 0,1 M y esterilizar con un filtro de 0,22 μm.
- Diluir 50 μg de plásmidos HC y LC pKym1 a 2,5 mL con medio sérico reducido. En un tubo separado, diluya 135 μL de reactivo de transfección a 2,5 mL con medio sérico reducido.
- Cinco minutos después de preparar las soluciones, mezcle los plásmidos y la solución del reactivo de transfección e incube durante 20 minutos para permitir la formación de complejos entre el ADN y el reactivo de transfección.
- Mientras tanto, centrifugar 125 millones de células a la densidad objetivo durante 5 minutos a 500 x g, resuspender con el medio de expresión que contiene CypK y añadir la mezcla de reactivo de ADN y transfección. CypK se puede comprar o sintetizar como se informó anteriormente.
- Después de incubar las células durante 20 h, añadir 250 μL de potenciadores de reactivos de transfección incluidos en el kit.
- Recolectar anticuerpos del sobrenadante 6-7 días después de la adición de CypK (no se requiere cambio de medio durante la extracción).
*Alternativamente, para obtener rendimientos más altos y consistentes, se puede generar una línea celular estable como se describe en Oller-Salvia et al. 2018. En este caso, trastuzumab(CypK)2 se expresa simplemente por la adición de CypK 5 mM en el medio de expresión.
- Purificar el anticuerpo
- Centrifugar las células durante 15 min a 3000 x g.
- Filtre el sobrenadante con un filtro de 0,45 o 0,22 μm. Si el filtro se ocluye, reemplácelo por uno nuevo y continúe filtrando. Si esto sucede después de solo unos pocos mililitros, centrifugue el sobrenadante durante 15 minutos adicionales a 7000 x g.
- Añadir resina de proteína A (2 mL/100 mL de sobrenadante) en una columna de cromatografía de polipropileno vacía y equilibrar la resina con al menos 5 volúmenes de tampón de lavado de perlas (0,1 M de fosfato sódico, 150 mM de NaCl).
- Divida el sobrenadante en dos tubos cónicos de 50 mL y agregue 5 veces tampón de lavado de perlas (0,5 M de fosfato de sodio, 150 mM de NaCl) seguido de la resina de proteína A preequilibrada. Coloque el tubo cónico en un rodillo durante 3 h a temperatura ambiente para tirar hacia abajo del anticuerpo en el sobrenadante.
- Alternativamente: Añadir el sobrenadante en la columna con al menos el doble del volumen recomendado de resina y dejar que fluya a través de él. Asegúrese de que no quede una cantidad significativa de anticuerpos en el sobrenadante por SDS-PAGE. Si lo hay, eluye el sobrenadante a través de la resina una vez más.
- Transfiera la resina de proteína A con el sobrenadante a una columna y permita que el líquido fluya a través de ella.
- Añadir 25 mL de tampón de lavado (o al menos 10 volúmenes de resina) y dejar fluir.
- Eluir el anticuerpo con 4 mL de citrato de sodio 0,1 M, pH 3, en 1 mL de tampón de fosfato 1 M, 150 mM de NaCl.
- Diluir el anticuerpo con 10 mL de PBS, concentrar a 0,5-1 mL por filtración centrífuga e intercambiar tampón tres veces con PBS.
- Purificar las muestras por FPLC utilizando una columna HIC de butilo con un caudal de 0,5 mL/min y un gradiente de 0-100% en 30 min de tampón bajo en sal (50 mM de fosfato sódico pH 7,0, 20% isopropanol) en tampón alto en sal (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM fosfato sódico pH 7,0, 5% isopropanol). Recoja todas las fracciones y controle la elución a 280 nm. Se pueden purificar pequeñas cantidades (< 1 mg) con HPLC-HIC en las condiciones descritas en el punto 2.4 para maximizar el rendimiento y la pureza.
- Agrupar las fracciones que contienen anticuerpos, diluirlas hasta al menos 4 ml con PBS, concentrarlas por filtración centrífuga e intercambiar tampón tres veces con PBS.
- Cuantificar el anticuerpo
- Obtenga una concentración aproximada midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes.
- Si se requiere una medición precisa, utilice un kit ELISA para medir las IgG humanas. Para obtener una estimación aproximada, use SDS-PAGE con una tinción a base de Coomassie de la siguiente manera:
- Prepare los patrones diluyendo seis veces el doble de un estándar de trastuzumab cuantificado por ELISA a 1 mg/mL.
- Hervir los patrones y las muestras a aproximadamente 0,25 mg/mL para reducir el tampón de carga.
- Ejecútelos en un 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE usando tampón MES-SDS y tiña con un tinte a base de Coomassie. Por último, mida la densidad de color de la banda correspondiente a la cadena ligera o pesada utilizando ImageJ e interpole la señal de las muestras en la curva estándar.
- Almacene el anticuerpo a 4 °C.
2. Conjugar el anticuerpo y caracterizar el ADC
- Conjugar el anticuerpo con la molécula portadora de tetrazina
- Diluir 10 equivalentes molares de tetrazina-vcMMAE (4 μL, 3,4 mM en dimetilsulfóxido (DMSO)) con 20 μL de acetonitrilo y 76 μL de PBS en un tubo cónico pequeño (por ejemplo, tubo de PCR).
- Añada 1 molar equivalente de trastuzumab(CypK)2 (100 μL, 2 mg/mL en PBS), mezcle bien y deje reaccionar durante 3 h a temperatura ambiente (25 °C) para formar trastuzumab(MMAE)2.
nota: Otras moléculas, como la tetrazina-5-TAMRA, pueden unirse al anticuerpo en lugar de la tetrazina-vcMMAE utilizando este protocolo.
- Purificar el ADC
- Preequilibre una columna de centrifugación de exclusión de tamaño con PBS siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Añadir todo el volumen de la reacción en la columna de centrifugación y centrifugar a 1500 x g durante 1 min.
- Cuantifique el ADC y analice el conjugado por SDS-PAGE
- Cuantifique el ADC como se describe en 1.3.2. midiendo la densidad de color de la cadena ligera en una SDS-PAGE utilizando el anticuerpo no modificado para la curva estándar.
- La cadena pesada debería haberse desplazado ligeramente, mostrando un aumento en el peso molecular en la conjugación.
Nota: Si el anticuerpo se modifica con un fluoróforo como en trastuzumab(TAMRA)2, solo la banda correspondiente a la cadena pesada debe mostrar fluorescencia en gel antes de la tinción.
- Analizar el conjugado por HPLC-HIC
- Equilibrar la columna de HPLC-HIC con tampón A al 100 % (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM de fosfato sódico pH 7,0, 5 % de isopropanol) durante 5 min.
- Mezcle 15 μL (67 pmol) de una solución de 1 mg/mL de trastuzumab(CypK)2 con 15 μL de tampón A 2x en un vial. A continuación, programe una inyección de 10 μL en la HPLC.
- Eluir en un flujo isocrático de 1 mL/min con 100% de tampón A durante 1 min seguido de un gradiente de 15 min de 100 a 0% de tampón A en B (50 mM de fosfato de sodio pH 7.0, 20% de isopropanol). Monitorizar la elución a 280 nm.
- Calcule el DAR integrando el pico correspondiente a cada especie y utilizando las áreas resultantes en la siguiente ecuación:
DAR = (1x trastuzumab(MMAE) + 2x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
El tiempo de retención esperado para trastuzumab(CypK)2 es de 7,5 a 8,0 min, para trastuzumab (CypK, MMAE) es de 9,1 a 9,6 min y para trastuzumab(MMAE)2 es de 10,5 a 11,0 min.