Cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia: una técnica para identificar la integridad de las proteínas de membrana fluorescentes tras la solubilización con detergente

Resumen

Fuente: Bird, L. E., et al. Cribado de expresión de proteínas de membrana en Escherichia coli basado en proteínas fluorescentes. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, demostramos una técnica de cromatografía de exclusión por tamaño de detección de fluorescencia para detectar la estabilidad de la proteína de membrana fusionada con proteína fluorescente verde (GFP) en Escherichia coli después de la solubilización con detergente. Las proteínas que exhiben un pico simétrico en el perfil de exclusión por tamaño con poca o ninguna GFP libre indican proteínas purificadas con una degradación y agregación mínimas, que posteriormente se pueden seleccionar para el análisis de estructura-función.

Protocolo

1.Solubilización y análisis de la fracción de membrana

1. Descongele la fracción de membrana (si es necesario) y, para cada detergente que se vaya a utilizar para la solubilización, alícuota 900 μl de la suspensión de membrana en un tubo de microcentrífuga de polialómero de 1,5 ml.
2. Añadir 100 μl de cada detergente recién preparado (soluciones al 10% p/v de DDM, DM, Cymal-6 y LDAO) hasta una concentración final del 1% en el tubo especificado de 1,5 ml. Para la solubilización de las proteínas de la membrana eucariota, se puede añadir hemisuccinato de colesterol (concentración final del 0,2%) a los detergentes.
3. Incubar las mezclas a 4 °C durante 1 hora con una agitación suave.
4. Granular la fracción insoluble del detergente con una ultracentrífuga de sobremesa, asegurándose de que los tubos estén al menos medio llenos, a 150.000 g a 4 °C durante 45 min y retengan el sobrenadante.
   nota: La efectividad de la solubilización del detergente se puede estimar utilizando un lector de placas fluorescentes midiendo la fluorescencia GFP de las membranas solubilizadas con la fracción insoluble del detergente resuspendida en el mismo volumen de PBS.
5. Analizar la monodispersidad de los diferentes complejos de proteínas detergentes: membranas mediante cromatografía de exclusión por tamaño detectada en fluorescencia (FSEC).
6. Para el análisis FSEC, equilibre una columna de exclusión por tamaño con un amplio rango de fraccionamiento, por ejemplo, de 5.000 a 5.000.000 de peso molecular, con tampón de funcionamiento (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,03% DDM) a un caudal de 0,3 ml/min. Utilice este tampón para todas las muestras, es decir, no se cambia para cada detergente probado.
7. Inyecte 100 μl de membranas solubilizadas en la columna a un caudal de 0,3 ml/min. Monitorice el perfil de elución mediante óptica de fluorescencia (excitación a 488 nm y emisión a 512 nm). Si no se dispone de un monitor de fluorescencia en línea, recoja las fracciones y lea la fluorescencia en un lector de placas.
8. Importe los datos de volumen de elución e intensidad de fluorescencia en un programa de hoja de cálculo para su visualización gráfica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hemisuccinato de colesterol	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-ciclohexilo-1-hexilo-βD-maltósido)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecil β-maltósido)	Generon	D97002
DM (n-Decyl β-maltósido)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimetil-ndodecilamina N-óxido)	Generon	D71111
Estándar de proteína fluorescente BenchMark	Tecnologías de la Vida	LC5928
Ultracentrífuga Optima L-100 con rotor de 45 Ti	Beckman Coulter	393253
Ultracentrífuga Optima Max-XP con rotor TLA-55	Beckman Coulter	393315
Prominence UFLC con detector de fluorescencia RF-20A	Shimadzu
Columna de exclusión de tamaño Sepharose 6 10/300 GL	GE Cuidado de la Salud	17-5172-01