Cromatografía de afinidad basada en DFE: una técnica para la purificación de anticuerpos monoclonales 2F5 a partir de una muestra cruda utilizando condiciones de elución basadas en alta fuerza iónica

Abstract

Fuente: Knödler, M. et al., Agarosa reticulada activada para el desarrollo rápido de resinas de cromatografía de afinidad - Captura de anticuerpos como estudio de caso. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe una técnica de cromatografía de afinidad para purificar anticuerpos monoclonales 2F5 utilizando los ligandos DsRed-2F5-Epitope o DFE. Los anticuerpos monoclonales 2F5 purificados son fármacos esenciales en inmunoterapia.

Protocol

1. Probando la purificación de mAbs a partir de extractos de plantas clarificadas

1. Prepare 100 mL de extracto de planta clarificado que contenga 2F55 o el sobrenadante del sistema de expresión celular preferido, que también contenga 2F5.
2. Prepare tampón de equilibrio (fosfato de sodio de 20 mM, cloruro de sodio de 500 mM, pH 7,4), tampón de elución de pH bajo (citrato de 0,05 M, cloruro de sodio de 0,05 M, pH 4,0-3,25) y tampón de elución de alta fuerza iónica (cloruro de magnesio de 1,0-4,0 M, HEPES de 0,1 M, pH 8,0)
3. Enjuague el sistema de cromatografía con los tampones. Monte una columna de afinidad DFE (consulte el texto principal del protocolo) en el sistema de cromatografía y equilibre con 5 CV de tampón de equilibrio a un caudal de 1,0 mL ^min-1. Controle la absorbancia UV a 280 nm.
   nota: La carga de extracto de plantas o sobrenadante de cultivo celular en la columna puede causar un aumento de la contrapresión. Establezca una alerta de alta presión a 0,2 MPa para evitar daños en el sistema de cromatografía o en la columna DFE.
4. Cargue 80 mL del extracto de planta clarificada o sobrenadante (paso 1.1) en la columna a un caudal de 0,5 mL min-1 para garantizar un tiempo de contacto de 2 min. Recoja las muestras de flujo en fracciones de 2 mL para la reconstrucción de la curva de ruptura. Almacene las muestras de flujo continuo a 4 °C si no es posible el análisis inmediato de la muestra.
5. Lavar la columna con 6 CV de tampón de equilibrio. Recoja una muestra del lavado al principio, a la mitad y al final de este paso.
6. Elute mAb 2F5 con 5 CV de tampón de elución de bajo pH o tampón de elución de alta fuerza iónica (0,1 M HEPES, 1,25 M de cloruro de magnesio, pH 8,0). Recoja la fracción DFE cuando la señal UV de 280 nm haya aumentado a 5 mAU por encima de la línea de base.
   1. Optimice el tampón de elución para cada par epítopo-anticuerpo. Para 2F5, el cloruro de magnesio 1,25 M logró un equilibrio óptimo entre la recuperación del producto y la estabilidad del ligando
      nota: La solución de cloruro de magnesio es propensa a la precipitación. Por lo tanto, disuelva el cloruro de magnesio en ~ 700 mL de agua. Disuelva por separado el HEPES en 100 ml de agua y ajuste el pH a 8,0. Añadir la solución de cloruro de magnesio disuelto a la solución HEPES y añadir agua hasta un volumen final de 1,0 L. No ajuste el pH después de disolver el cloruro de magnesio porque esto provocará precipitaciones.
7. Analice todas las muestras tomadas durante los pasos 1.4 a 1.6 utilizando el método de Bradford, la electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de litio (LDSPAGE) y la espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRed	Fraunhofe IME	N/A	Estándar
HiTrap NHS Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Columnas de cromatografía
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Componente de búfer
Cloruro de magnesio	Carl Roth GmbH	KK36.2	Componente de búfer
PH 3110	WTW (en inglés)	2AA110	Medidor de pH
Sephadex G-25 fino, dextrano reticulado	GE Helthcare	17003301	Resina de cromatografía
cloruro de sodio	Carl Roth GmbH	P029.2	Componente de búfer
Citrato de sodio	Carl Roth GmbH	HN13.2	Componente de búfer