Ensayo de actividad enzimática basado en cromatografía en capa fina: una técnica para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa in vitro mediante cromatografía en capa fina

Resumen

Fuente: Pokhrel, A., et al. A Ensayo de purificación y actividad in vitro para una (p)ppGpp sintetasa de Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra un ensayo enzimático basado en cromatografía en capa fina para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa utilizando nucleótidos radiomarcados. El método proporciona información sobre la síntesis de nucleótidos y las reacciones de fosfotransferencia.

Protocolo

1. Ensayo de actividad proteica por cromatografía en capa fina

1. Prepare la placa de cromatografía en capa fina (TLC).
   1. Prepare placas de polietileno (PEI)-celulosa lavándolas con agua desionizada. Coloque las placas en una cámara de vidrio con agua destilada doble a una profundidad de ~ 0,5 cm.
   2. Permita que el agua migre a la parte superior del plato.
      NOTA: El lavado de las placas no es estrictamente necesario, ya que las placas se pueden usar sin él, pero el lavado aumenta la claridad de las imágenes resultantes. El lavado de las placas en dos direcciones perpendiculares garantiza aún más que cualquier contaminante presente en la resina se aísle en una esquina de la placa (Figura 1).
   3. Saque las placas de la cámara de vidrio y déjelas secar en una rejilla de sobremesa durante la noche (12-18 h).
   4. Marque las placas secas a 2,0 cm de un borde con un lápiz suave para indicar dónde se aplicarán las muestras para TLC. Para muestras de 2 μL, aplique las muestras a no menos de 1,0 cm de distancia (Figura 1).
      NOTA: Esto permite una separación clara entre puntos adyacentes, lo cual es fundamental para la cuantificación de la señal. Siempre que la resina de celulosa no se raye, las pequeñas marcas de lápiz en la superficie no interferirán con la migración del solvente.
   5. Cuando planifique experimentos, deje siempre un lugar en cada plato sin usar.
      NOTA: Esto proporcionará un carril en blanco para la cuantificación de muestras (Figura 1). Un plato TLC de 20 cm tendrá espacio para 19 puntos.
2. Ensayo de actividad enzimática
   1. Prepare una mezcla tampón 5x que contenga 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM de acetato de amonio, 10 mM de KCl, 1 mM de DTT y 0,6 mM de ATP (trifosfato de adenosina).
      NOTA: Esta mezcla puede prepararse en grandes cantidades y congelarse en alícuotas de 10 μL para su uso posterior. No someta la mezcla a múltiples ciclos de congelación y descongelación.
   2. Prepare reacciones individuales que contengan 3 μM de RSH (enzimas homólogas Rel/Spo), 1x mezcla tampón, 0,6 mM GDP (difosfato de guanosina), 1,2 mM de MgCl₂. Añadir 1,0 μCi de ^γ-32P-ATP (ATP radiomarcado) por cada 10 μL de reacción y utilizar agua libre de nucleasa para llevar la reacción al volumen deseado. Agregue la RSH después de que se hayan mezclado los otros componentes, ya que la adición de RSH a la mezcla que contiene nucleótidos inicia el ensayo de actividad enzimática.
      NOTA: El volumen final de la reacción dependerá del número de puntos de tiempo muestreados. Para muestrear 2 μL/punto de tiempo, ensamble 10 μL de mezcla de reacción para cada 4 puntos de tiempo.
   3. Para controlar la hidrólisis del ATP de la actividad contaminante de la nucleasa, ensamble una reacción de 10 μL que no contenga proteínas e incube en paralelo. Localice muestras de 2 μL en t = 0 y al final del experimento para asegurarse de que el ATP no se hidrolizó en ausencia de proteína.
   4. Inmediatamente después de la adición de RSH, extraiga 2 μL y colóquelo en la placa de celulosa de PEI etiquetada como muestra t = 0 min.
   5. Incubar la reacción a 37 °C, eliminando 2 μL de alícuotas en los puntos de tiempo deseados.
      NOTA: La actividad enzimática cesará cuando la muestra se adsorba en la placa de celulosa. Espere de 10 a 30 minutos después de agregar el último punto a la placa antes del revelado para garantizar la adsorción completa y el secado de la muestra.
3. Cromatografía en capa fina
   1. Llene la cámara de cromatografía con 1,5 M, 1,5 M, KH,₂, PO₄ (pH 3,64) hasta una profundidad de 0,5 cm.
      NOTA: El volumen necesario dependerá de las dimensiones del tanque de cromatografía. Cualquier recipiente de vidrio con un fondo nivelado que sea lo suficientemente ancho como para permitir la inserción de la placa TLC sin doblarse se puede usar como tanque de revelado con la adición de una tapa. La placa TLC se puede cortar en tiras más estrechas con una cuchilla de afeitar limpia para permitir el desarrollo en un vaso de vidrio cubierto con una película de plástico.
   2. Sumerja el borde inferior de la placa en disolvente. Deje que el solvente migre a la parte superior de la placa (~ 90 min).
      NOTA: Si bien la migración de solvente se detendrá en la parte superior de la placa y las muestras no se perderán ni se juntarán durante una inmersión más larga, las placas no deben dejarse en solvente durante la noche. Las inmersiones de más de 4 h pueden hacer que la resina se desprenda del soporte de la placa y provoque la pérdida de señal.
   3. Retire la placa del tanque de cromatografía y colóquela en una rejilla de secado de sobremesa.
   4. Deje que la placa se seque al aire durante la noche.
      NOTA: El secado puede acelerarse con un secador de pelo. La sequedad se puede evaluar por el color de la resina, que se oscurecerá cuando esté mojada y volverá al color de una placa sin usar cuando esté completamente seca.
   5. Después de que la placa esté seca, envuélvala en una película de plástico para evitar la transferencia de material radiactivo al casete de imágenes y analícela mediante autorradiografía (Figura 2).
4. análisis de datos
   1. Exponga la placa de PEI-celulosa que contiene reacciones separadas a un casete de fosforogenerador durante 4 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Esta exposición es suficiente para producir una imagen muy clara utilizando las concentraciones indicadas de ^γ-32P-ATP fresco. Si se utilizan cantidades más bajas de sustrato radiomarcado, el tiempo de exposición puede aumentarse a 12-16 h.
   2. Imagine el casete en un generador de imágenes de fósforo.
   3. Utilizando un software de creación de imágenes con una interfaz gráfica de usuario, dibuje regiones de interés (ROI) seleccionando Dibujar rectángulo y utilizando el ratón para dibujar ROI rectangulares alrededor de un carril completo y los puntos de ATP y ppGpp (tetrafosfato de guanosina) contenidos en ese carril (Figura 2).
   4. Utilice los comandos Seleccionar, Copiar y Pegar (o los comandos correspondientes basados en el software de creación de imágenes que se esté utilizando) para dibujar ROI idénticos dentro de los otros carriles para asegurarse de que los ROI estén midiendo la señal dentro de áreas idénticas en cada carril. Incluya los ROI de un carril no utilizado, para utilizarlos como espacios en blanco.
   5. El uso de la aplicación Analizar | Herramientas | Gerente de ROI | Agregue comandos del software de imágenes, seleccione todos los ROI dibujados en la placa de celulosa PEI.
   6. El uso de la aplicación Analizar | Establecer medidas | Mida los comandos, cuantifique la intensidad de la señal dentro de cada ROI y exporte las mediciones como una hoja de cálculo (Figura 2). Reste los valores de ROI en blanco de las señales experimentales.
      
   7. Calcule qué porcentaje de la señal suprimida dentro de cada carril es atribuible a ATP y ppGpp utilizando las fórmulas.
      NOTA: Los ROI pueden extraerse y cuantificarse utilizando software comercial compatible con el phosphorimager o el software ImageJ disponible gratuitamente (Institutos Nacionales de Salud).

Resultados

Figura 1: Preparación de las placas TLC. (A) Las placas se lavan en una dimensión colocando el borde inferior en agua (azul). Los contaminantes (amarillos) migran a la parte superior de la placa con el solvente. (B) Después de que una placa se seca completamente, se lava en una segunda dimensión girándola 90 ° en relación con el primer lavado y nuevamente permitiendo que el agua migre a la parte superi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tanque de revelado de cromatógrafo de capa fina (TLC)	Empresa General de Soplado de Vidrio	80-3
Placas de polietilenimina (PEI)-celulosa (20 cm x 20 cm, 100 μm de espesor) con soporte de poliéster	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml de plomo, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adenosina 5'-trifosfato (ATP) 100 mM	Bio Básico Canadá	AB0311
Sal disódica de guanosina-5'-difosfato (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Pantalla de fósforo de almacenamiento	GE Healthcare Ciencias de la Vida	Criba de tritio BAS-IP TR 2040 E
Generador de imágenes de fósforo Storm 860	GE Healthcare Ciencias de la Vida	-