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1. Cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) para semicuantificar la cantidad de varios lípidos, incluidos el colesterol, los fosfolípidos y la esfingomielina
- Prepare las siguientes cuatro soluciones de funcionamiento y soluciones de tinción.
- Solución 1: Mezcle acetato de etilo (26,6 %), 1-propanol (26,6 %), cloroformo (26,6 %), metanol (26,6 %) y cloruro de potasio (9,6 %). Prepare KCl disolviendo 0,25 g de KCl en 100 ml de agua con calidad HPLC.
- Solución 2: Mezcle n-hexano (73%), éter dietílico (23%) y ácido cítrico (2%).
- Solución 3: 100% n-hexano.
- Prepare la solución de tinción mezclando agua destilada (90 mL) con 7,5 g de sulfato de cobre y luego agregue 10 mL de ácido fosfórico.
- Llene hasta 5 mm de cada solución en una cámara de vidrio separada. Agregue cualquier tipo de papel de filtro para aumentar la velocidad de funcionamiento en cada cámara.
- Preincube una placa de vidrio de gel de sílice HPTLC 60 de 20 x 10 cm en la primera solución de funcionamiento hasta que la solución de funcionamiento llegue a la parte superior de la placa. A continuación, séquelo durante 10 min a 110 °C.
nota: Estas placas pueden almacenarse para su uso futuro en papel de aluminio y secarse durante 10 minutos a 110 °C antes de su uso.
- Disolver una pastilla lipídica obtenida a partir de neutrófilos derivados de la sangre periférica humana en 200 μL de solución de cloroformo/metanol (1:1) e incubar durante 15 min a 37 °C para que se disuelva.
- Utilice una regla y un lápiz suave para marcar los puntos de carga para el número deseado de muestras, además de al menos un estándar. Marque la distancia de carrera en aproximadamente 4 cm y 6 cm para la primera y segunda solución de carrera, respectivamente.
- Para cargar las muestras, lave la jeringa de 10 μL 3 veces en cloroformo/metanol (1:1) antes de cargar cada nueva muestra. Cargue 10 μL de cada muestra gota a gota, tratando de concentrar la muestra en un área lo más pequeña posible. Las muestras deben cargarse al menos por duplicado.
- Coloque la placa verticalmente en la primera cámara con solución corriente 1 (paso 1.1.1). Asegúrese de que la placa esté paralela a la pared de la cámara de vidrio para lograr una velocidad de migración uniforme.
- Una vez que la línea de solvente haya alcanzado la primera marca, retire la placa, séquela y colóquela en la segunda solución. Repita pasos similares para la segunda y para la tercera solución en ejecución; Deje la placa en la solución hasta que el frente del solvente llegue a la parte superior de la placa, luego retírela y séquela a RT durante 1 min.
- Coloque la placa en una solución de sulfato de cobre durante 7 s. Retire la placa, séquela bien y hornee en un horno durante 7 minutos a 170 °C. Espere a que la placa se enfríe.
- Utilizando un software de cromatografía en capa fina y análisis de gel, así como un software de procesamiento de imágenes, escanee y analice para identificar las bandas de lípidos resueltas.