1. Preparación de tampones y soluciones
NOTA: Todos los buffers y soluciones utilizados en el protocolo se resumen en la Tabla 1. Los volúmenes dados de los tampones son suficientes para preparar y procesar 10 muestras. Todos los tampones pueden almacenarse a +4 °C durante un máximo de un año.
- Prepare 20 mL de tampón de gel 3x que contenga 1,5 M de ácido aminocaproico, 150 mM de Bis-tris en agua destilada (dH2O). Ajusta el pH a 7.0.
- Preparar 10 mL de ácido aminocaproico 2 M en dH2O.
- Prepare 1 mL del tampón mitocondrial combinando lo siguiente: 0,5 mL de tampón de gel 3x, 0,5 mL de ácido aminocaproico 2 M y 4 μL de EDTA 500 mM.
- Prepare 1.000 mL de tampón catódico que contenga 15 mM de Bis-tris y 50 mM de tricina endH2O. Ajuste el pH a 7.0.
- Prepare 200 mL de tampón de cátodo azul añadiendo 0,04 g de azul de Coomassie G-250 a 200 mL de tampón de cátodo.
- Prepare 1.000 mL de tampón de ánodo que contenga 50 mM de Bis-tris en dH2O. Ajuste el pH a 7,0.
- Prepare 2,5 mL de tampón de muestra que contenga 750 mM de ácido aminocaproico y 5% de azul de Coomassie G-250 en dH2O.
>2. Preparación de lisados mitocondriales
- Coloque las celdas en placas el día antes de la recolección. Para las células HEK293 o 143B, utilice el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina, 100 mg/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Cultive las células en una incubadora de cultivo celular a +37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2. Asegúrese de que haya al menos 500.000 células para cada muestra el día de la recolección.
- Lave suavemente las celdas una vez con PBS helado. Evite separar las células de la placa. Raspar las celdas y granularlas a 800 x g durante 10 min a +4 °C.
- Lave el pellet de celda dos veces con PBS helado y centrifugue como en el paso 2.2. Mida la concentración de proteínas con el método Bradford utilizando un kit comercial. Granular las celdas a 800 x g durante 10 min a +4 °C.
nota: Después de la recolección de células, realice todos los pasos a +4 °C y no haga vórtices.
- Prepare 20 mL de PBS con inhibidor de la proteasa agregando 200 μL de inhibidor de la proteasa 100x a 20 mL de PBS. Mantener en hielo. Resuspender las células en PBS con inhibidor de la proteasa hasta una concentración final de proteína de 5 mg/mL.
- Para calcular el volumen de PBS con inhibidor de la proteasa necesario para resuspender las células a 5 mg/mL, se calculó la cantidad de proteína en cada muestra. Para este cálculo, utilice la concentración de proteínas medida en el paso 2.3 y el volumen de PBS utilizado para resuspender las células después del lavado en el paso 2.3.
- Prepare 1 mL de digitonina 3.3 mM en PBS con inhibidor de proteasa. Añadir 3,3 mM de digitonina a una concentración final de 1,65 mM. Mezclar bien e incubar en hielo durante 5 min.
- Para preparar 1 mL de digitonina 3,3 mM en PBS con inhibidor de la proteasa, disuelva 4 mg de digitonina en 1 mL de PBS a 100 °C hasta que no haya precipitado visible y enfríe en hielo inmediatamente. Añadir 10 μL de inhibidor de la proteasa 100x a 1 mL de solución de digitonina.
nota: Utilice solo una solución nueva de digitonin.
cautela: ¡La digitonina es tóxica! Use una mascarilla, guantes y una bata de laboratorio.
- Añadir PBS con inhibidor de la proteinasa (preparado en el paso 2.4) hasta el volumen final de 1,5 mL. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a +4 °C. Retirar el sobrenadante. En este paso, las mitocondrias se granulan.
- Vuelva a suspender el pellet mitocondrial en el tampón mitocondrial. El volumen de tampón mitocondrial es la mitad del volumen de PBS en el paso 2.4.
- Prepare lauril maltósido fresco al 10% en PBS que contenga inhibidor de la proteasa (preparado en el paso 2.4): 1 ml es suficiente para 10 muestras. Añadir un 10% de lauril maltósido a la concentración final del 1%. Incube en hielo durante 15 minutos (este paso puede ser más largo, hasta un par de horas).
- Centrifugar a 20.000 x g durante 20 min a +4 °C. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. Mida la concentración de proteínas por el método de Bradford utilizando un kit. Agregue tampón de muestra, un volumen que sea la mitad del volumen de lauril maltósido utilizado en el paso 2.8. Las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
>3. Preparación de gel degradado para BN-PAGE
- Vierta el gel degradado para BN-PAGE a temperatura ambiente. Coloque el generador de gradiente en una placa de agitación y conéctelo con un tubo flexible a la bomba peristáltica. Conecte un equipo de infusión con la aguja al tubo. Coloque un agitador magnético en la cámara proximal del generador de degradados. Lave el tubo con dH2O a la velocidad máxima de la bomba durante 10 min.
- Vacíe el tubo y el generador de degradado. Utilice una pipeta para eliminar los restos de dH2O en el canal entre las cámaras del generador de degradado. Cierre el canal y el tubo con la válvula.
- Usando el marco de fundición y las abrazaderas, ensamble dos placas de vidrio en el soporte, que tiene un orificio en la parte inferior, y colóquelo en el soporte. Asegúrese de que esté más o menos en una superficie recta con un equilibrio de agua. Coloque la aguja conectada al tubo entre las placas de vidrio.
- Preparar soluciones de gel al 6% y al 15% (Tabla 2). Mantener en hielo. Agregue persulfato de amonio (APS) y tetrametilendiamina (TEMED) (inician la polimerización) al final. Mezcle suavemente para evitar que se formen burbujas de aire.
- Cargue el extremo proximal de la cámara de tubos del mezclador de gel degradado con un 6 % de gel y el extremo distal con un 15 % de gel. El volumen total del gel debe ser igual al volumen del gel de separación entre las placas de vidrio. Por lo tanto, use 2,6 mL de gel al 6% y 2,1 mL de gel al 15% en el mezclador de gel degradado para un gel de 8,3 cm x 7,3 cm.
- Encienda el agitador magnético y abra el tubo y el canal entre las cámaras del generador de degradado. Conecte inmediatamente la bomba peristáltica a 5 mL/min. Llene las placas de vidrio y no permita que entren burbujas en el gel. Retire la aguja cuando no haya gel en el tubo.
- Cubra suavemente el gel con dH2O. Mantenga el gel a temperatura ambiente durante al menos 1 h para la polimerización.
- Inmediatamente después de verter el gel, lave el tubo llenando las cámaras de gradiente con dH2O y utilizando la bomba peristáltica a la velocidad máxima. Al preparar dos o más geles, limpie siempre el sistema en el medio.
- Prepare 1x tampón de gel mezclando 3 mL de tampón de gel 3x y agregue 6 mL de dH2O. Retire dH2O de la superficie del gel con papel de filtro suavemente. Lave la superficie del gel con 1x tampón de gel. Retire suavemente 1x tampón de gel con papel de filtro.
- Evite las fibras del papel de filtro en el gel. Para asegurar esto, corte el papel en pedazos pequeños con unas tijeras, pero no rasgue el papel.
- Coloque el peine entre las placas de vidrio, pero no lo sumerja completamente para poder verter el gel apilante debajo del peine. Prepare el gel apilante al 4% (Tabla 2). Agregue APS y TEMED al final, ya que comienzan la polimerización fácilmente. Mezclar suavemente evitando las burbujas de aire.
- Superponga el gel de apilamiento, evitando las burbujas debajo del peine, y sumerja el peine por completo. Deje que el gel apilador polimerice durante al menos 30 minutos. Retire el peine y lave los pocillos con 1x tampón de gel usando una pipeta.
- Después de la polimerización, el gel puede almacenarse a +4 °C durante un par de días. Para almacenar el gel, envuelva el gel en papel empapado con dH2O y película de plástico para evitar que el gel se seque.
4. Electroforesis en gel nativo azul
NOTA: Para evitar la degradación de los complejos OXPHOS, ejecute la electroforesis a +4 °C. Utilice tampones preenfriados.
- Cargue el casete de gel con el tampón de cátodo azul hasta el fondo de los pocillos. La carga de las muestras es más fácil cuando el casete no está lleno hasta la parte superior. Lave los pocillos con el tampón de cátodo azul y, a continuación, llene los pocillos con el tampón de cátodo azul con pipeta.
- Cargue las muestras (5-30 μg de proteína) en pocillos. Llene suavemente el casete de gel hasta la parte superior con el tampón de cátodo azul y el tanque con tampón de ánodo.
- Haga funcionar el gel durante 15 minutos a un voltaje constante de 40 V. Luego aumente el voltaje a 80 V (o use una corriente constante de 6 mA), no exceda los 10 mA. Pasa el gel hasta que el tinte alcance 2/3 de la longitud del gel.
- Reemplace el tampón de cátodo azul con tampón de cátodo y continúe la electroforesis hasta que se haya agotado el frente de tinte. En total, la electroforesis dura unas 3 horas.
- Recupere las placas de vidrio y transfiera las proteínas a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante transferencia semiseca.
