Ensayo de inmunoperlas multianalitos: una técnica de inmunoensayo basada en flujo para la detección simultánea de múltiples subtipos de anticuerpos en muestras de suero humano

Resumen

Fuente: Fhied, C. L. et al., Monitoreo dinámico de la seroconversión utilizando un ensayo de inmunoperlas multianalítico para Covid-19. J. Vis. Exp. (2022).

Este video describe una técnica de inmunoensayo que utiliza perlas magnéticas fluorescentes o microesferas junto con diferentes antígenos para detectar simultáneamente varios isotipos de anticuerpos en una muestra de suero. El ensayo es útil para comprender la seroconversión durante una infección o después de la vacunación.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Preparación de microesferas conjugadas con antígenos

1. Seleccione tres viales diferentes de microesferas magnéticas con regiones de perlas únicas, registrando la identificación de las perlas y la información del lote para cada vial utilizado.
   nota: Se seguirán los siguientes pasos para cada región de microesfera distinta. Las microesferas son sensibles a la luz y deben protegerse de la exposición prolongada a la luz. Durante los pasos de lavado, tenga cuidado de no alterar las microesferas. Si se le molesta, permita una segunda separación de 60 s.
2. Agite el material de microesferas durante 60 s y sonique durante 5 minutos antes de usarlo para disociar las perlas agregadas.
3. Transfiera 1,0 x 10⁶ perlas a tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 mL.
4. Inserte el tubo en un separador magnético y deje que se produzca la separación durante 60 s. Con el tubo aún en el separador magnético, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la bolita de perlas.
5. Retire el tubo del separador magnético, vuelva a suspender las perlas con 100 μL de agua apta para HPLC y vórtice durante 30 s. Vuelva a colocar el tubo en el separador magnético durante 60 s y, a continuación, retire el sobrenadante. Repita este protocolo de lavado dos veces.
6. Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas lavadas en 90 μL de fosfato sódico monobásico de 100 mM, pH 6,2 (tampón de activación) por vórtice durante 30 s.
7. Añadir 10 μL de 50 mg/mL de Sulfo-NHS (diluido con tampón de activación) a las microesferas y a la vórtice suavemente durante 10 s. Añadir 10 μl de solución EDC de 50 mg/mL (diluida con tampón de activación) y vórtice suavemente durante 10 s. Incubar las microesferas durante 20 min a temperatura ambiente (RT) con un vórtice suave cada 10 min.
8. Repita los pasos de lavado 1.4-1.5 con 50 mM MES, pH 5.0 (tampón de acoplamiento) en lugar de agua de grado LC/MS para un total de dos lavados.
9. Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las perlas con 100 μL de tampón de acoplamiento por vórtice durante 30 s, seguido inmediatamente de la adición de la cantidad deseada de proteína.
10. Lleve el volumen total a 150 μL con el tampón de acoplamiento. Mezclar la reacción de acoplamiento por vórtice durante 30 s e incubar durante 2 h por rotación a RT.
    nota: Para los ensayos definidos en este documento, las conjugaciones se realizaron con las siguientes concentraciones de proteínas: Spike S1: 5 μg; Nucleocápside: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
11. Repita el paso de lavado 1.4 con solución salina tamponada con fosfato (PBS)-1% de albúmina sérica de cabra, 0.01% de polisorbato-20 (tampón de enfriamiento) en lugar de agua de grado LC/MS para un total de dos lavados. Vuelva a suspender las microesferas lavadas en 100 μL de tampón Quench que contiene azida de sodio al 0,05% por vórtice durante 30 s.
    nota: Deje que las perlas se enfríen completamente durante al menos 6 horas antes de continuar con cualquier otro procedimiento.
12. Cuente el número de microesferas recuperadas utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Registre la concentración de perlas observada.
13. Refrigere las microesferas acopladas a 4 °C en la oscuridad.

2. Procedimientos

1. Rendimiento del ensayo (protocolo base)
   1. Vuelva a suspender las microesferas acopladas por vórtice durante 30 s y sonique durante ~60-90 s.
   2. Retire la cantidad requerida de cada coloide de perlas del tubo respectivo y combine los coloides de perlas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Inserte el tubo en un separador magnético y deje que se produzca la separación durante 60 segundos. Con el tubo aún en el separador magnético, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la bolita de perlas.
   4. Retire las perlas del separador, vuelva a suspender las perlas con 100 μL de PBS-1% de albúmina sérica bovina, 0,01% de polisorbato-20 (tampón de ensayo) y vórtice durante 30 s. Coloque el tubo en un separador magnético y deje que se produzca la separación durante 60 s. Repita este protocolo de lavado (es decir, los pasos 2.1.3-2.1.4) dos veces.
   5. Ajuste la concentración de la mezcla de microesferas de trabajo 3-plex añadiendo un volumen adecuado de tampón de ensayo para generar una concentración final de 100 microesferas por 1 μL para cada objetivo.
   6. Alícuota 12,5 μL de la mezcla de microesferas preparada en el paso 2.1.5 en cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 25 μL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
   7. Diluya las muestras de plasma/suero 500 veces en tampón de ensayo. Prepare las muestras estándar de acuerdo con la valoración deseada.
   8. Agregue 12,5 μL de tampón de ensayo como muestra en blanco y agregue cada una de las muestras diluidas o patrón en cada pocillo designado de una placa de muestra de 384 pocillos o 25 μL de la muestra en blanco, diluida o patrón en cada pocillo de una placa de muestra de 96 pocillos.
   9. Cubra la placa con un sello de aluminio o papel de aluminio e incube durante 1 h a RT en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
      nota: En la Tabla 1 se proporciona un esquema de las curvas de dilución.
   10. Prepare una solución de anticuerpos de detección antihumanos (soluciones de anticuerpos secundarios) a 4 μg/ml con tampón de ensayo como se especifica en el paso 2.1.11.
   11. Prepare IgM antihumana de cabra, conjugada con anticuerpos de detección de conjugados Super Bright 436 (SB)/IgA antihumana de cabra, ficoeritrina (PE) a 4 μg/mL; o anticuerpos de detección de IgM antihumana de cabra, conjugada SB / IgG antihumana de cabra, PE conjugados a 4 μg/mL.
       nota: Para un formato de placa de 384 pocillos, se requieren 12,5 μL/pocillo de la solución de anticuerpo secundario preparada, y para un formato de placa de 96 pocillos, se requieren 25 μL/pocillo.
   12. Coloque la placa en un separador magnético, lávela rápidamente e inviértala con fuerza sobre un recipiente de riesgo biológico para eliminar el líquido de los pozos. Con el plato aún invertido, golpee con fuerza el plato contra un trozo grueso de papel.
   13. Lave cada pocillo con 100 μL de tampón de ensayo y elimine el líquido mediante una inversión forzada sobre un recipiente de riesgo biológico, como se describió anteriormente. Repita estos pasos (2.1.12-2.1.13) para un total de dos lavados. Deseche todos los fajos de papel usados en un contenedor de riesgo biológico.
   14. Agregue 12,5 μL de la solución de trabajo de anticuerpos secundarios a cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 25 μL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con un sello de aluminio o papel de aluminio e incube durante 30 minutos a RT en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
   15. Repita los pasos de lavado 2.1.12-2.1.13.
   16. Agregue 75 μL de tampón de ensayo en cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 100 μL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con un sello de aluminio o papel de aluminio e incube durante 5 minutos a RT en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
   17. Analice 60 μL a través del analizador de instrumentos de acuerdo con el manual del sistema.

Tabla 1: Serie de dilución para curvas estándar: Tabla de factores de dilución utilizados para las curvas estándar para el serotipo IgG; presentada como una curva de dilución en serie 1:5 de 7 puntos que comienza en 1 μg/mL para α-Spike S1 y α-Nucleocápside y 5 μg/mL para anticuerpos α-Membrane.

Número estándar	Serie de dilución	Anti-pico S1 o N (μg/mL)	Antimembrana (μg/mL)
espacio en blanco	espacio en blanco	-	-
1	STD7 1:1	1	5
número arábigo	STD6 1:5	0.2	1
3	STD5 1:25	0.04	0.2
4	STD4 1:125	0,008	0.04
5	STD3 1:625	0.0016	0,008
6	STD2 1:3125	0.00032	0.0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de microtitulación de poliestireno negro de 384 pocillos	Termo Fisher	Teléfono 12-565-346
Tampón de activación (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)	Preparado en casa
Tampón de ensayo (PBS, 1% albúmina sérica bovina, 0,01% polisorbato-20)	Preparado en casa
Albúmina sérica bovina, fracción de choque térmico	MilliporeSigma	A-7888-50G
Tampón de acoplamiento (50 mM MES, pH 5,0)	Preparado en casa
Proteína de matriz recombinante del coronavirus COVID 19 M (6xHistag)	MyBioSource (Mi Fuente Biológica)	MBS8574735
Puntas de pipeta desechables
EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida)	Termo Fisher	PIA35391
Albúmina de cabra, fracción V en polvo	Millipore Sigma	A2514-1G
IgA Cabra anti-Humano, R-PE, Policlona	Termo Fisher	OB205009
IgG Cabra antihumana, R-PE, Policlonal	Termo Fisher	OB204009
IgG Cabra anti-Conejo, R-PE, Policlonal	Termo Fisher	OB403009
gM Cabra anti-Humano, R-PE, Policlonal	Termo Fisher	OB202009
Ratón IgM anti-humano, SB 436, clon SA-DA4	Termo Fisher	62999842
Analizador de instrumentos	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
Tubos de microcentrífuga de baja ligada (1,5 mL)	Termo Fisher	13-698-794
Microesferas MagPlex-C, Región XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
Hidrato de MES (hidrato de ácido 2-(N-Morpholino) etano sulfónico)	MilliporeSigma	M2933
Cinta de sellado de aluminio microplaca	Termo Fisher	07-200-683
Polisorbato-20	Termo Fisher	BP337-500
Calidad Biológica Inc. PBS, pH 7.2	Termo Fisher	50-751-7328
Tampón de enfriamiento (PBS, 1% albúmina sérica de cabra, 0,01% polisorbato-20)	Preparado en casa
Proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (etiqueta de He)	Sino Biologicals	40588-V08B
Proteína de pico del SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (subunidad S1, etiqueta de He)	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Anticuerpo, pAb de conejo	Sino Biologicals	40592-T62
Anticuerpo de nucleocápside contra el SARS-CoV-2 (2019-nCoV), mAb de conejo	Sino Biologicals	40588-R0004
Anticuerpo de membrana (IN) contra el SARS-CoV-2 (COVID-19), pAb de conejo	ProSci	10-516
Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	Termo Fisher	PIA39269
Tampón de lavado (PBS, 0,01% polisorbato-20)	Preparado en casa
Agua, grado LC/MS	Termo Fisher	W-64