Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación de microesferas conjugadas con antígenos
- Seleccione tres viales diferentes de microesferas magnéticas con regiones de perlas únicas, registrando la identificación de las perlas y la información del lote para cada vial utilizado.
nota: Se seguirán los siguientes pasos para cada región de microesfera distinta. Las microesferas son sensibles a la luz y deben protegerse de la exposición prolongada a la luz. Durante los pasos de lavado, tenga cuidado de no alterar las microesferas. Si se le molesta, permita una segunda separación de 60 s.
- Agite el material de microesferas durante 60 s y sonique durante 5 minutos antes de usarlo para disociar las perlas agregadas.
- Transfiera 1,0 x 106 perlas a tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 mL.
- Inserte el tubo en un separador magnético y deje que se produzca la separación durante 60 s. Con el tubo aún en el separador magnético, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la bolita de perlas.
- Retire el tubo del separador magnético, vuelva a suspender las perlas con 100 μL de agua apta para HPLC y vórtice durante 30 s. Vuelva a colocar el tubo en el separador magnético durante 60 s y, a continuación, retire el sobrenadante. Repita este protocolo de lavado dos veces.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas lavadas en 90 μL de fosfato sódico monobásico de 100 mM, pH 6,2 (tampón de activación) por vórtice durante 30 s.
- Añadir 10 μL de 50 mg/mL de Sulfo-NHS (diluido con tampón de activación) a las microesferas y a la vórtice suavemente durante 10 s. Añadir 10 μl de solución EDC de 50 mg/mL (diluida con tampón de activación) y vórtice suavemente durante 10 s. Incubar las microesferas durante 20 min a temperatura ambiente (RT) con un vórtice suave cada 10 min.
- Repita los pasos de lavado 1.4-1.5 con 50 mM MES, pH 5.0 (tampón de acoplamiento) en lugar de agua de grado LC/MS para un total de dos lavados.
- Retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las perlas con 100 μL de tampón de acoplamiento por vórtice durante 30 s, seguido inmediatamente de la adición de la cantidad deseada de proteína.
- Lleve el volumen total a 150 μL con el tampón de acoplamiento. Mezclar la reacción de acoplamiento por vórtice durante 30 s e incubar durante 2 h por rotación a RT.
nota: Para los ensayos definidos en este documento, las conjugaciones se realizaron con las siguientes concentraciones de proteínas: Spike S1: 5 μg; Nucleocápside: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
- Repita el paso de lavado 1.4 con solución salina tamponada con fosfato (PBS)-1% de albúmina sérica de cabra, 0.01% de polisorbato-20 (tampón de enfriamiento) en lugar de agua de grado LC/MS para un total de dos lavados. Vuelva a suspender las microesferas lavadas en 100 μL de tampón Quench que contiene azida de sodio al 0,05% por vórtice durante 30 s.
nota: Deje que las perlas se enfríen completamente durante al menos 6 horas antes de continuar con cualquier otro procedimiento.
- Cuente el número de microesferas recuperadas utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Registre la concentración de perlas observada.
- Refrigere las microesferas acopladas a 4 °C en la oscuridad.
2. Procedimientos
- Rendimiento del ensayo (protocolo base)
- Vuelva a suspender las microesferas acopladas por vórtice durante 30 s y sonique durante ~60-90 s.
- Retire la cantidad requerida de cada coloide de perlas del tubo respectivo y combine los coloides de perlas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Inserte el tubo en un separador magnético y deje que se produzca la separación durante 60 segundos. Con el tubo aún en el separador magnético, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la bolita de perlas.
- Retire las perlas del separador, vuelva a suspender las perlas con 100 μL de PBS-1% de albúmina sérica bovina, 0,01% de polisorbato-20 (tampón de ensayo) y vórtice durante 30 s. Coloque el tubo en un separador magnético y deje que se produzca la separación durante 60 s. Repita este protocolo de lavado (es decir, los pasos 2.1.3-2.1.4) dos veces.
- Ajuste la concentración de la mezcla de microesferas de trabajo 3-plex añadiendo un volumen adecuado de tampón de ensayo para generar una concentración final de 100 microesferas por 1 μL para cada objetivo.
- Alícuota 12,5 μL de la mezcla de microesferas preparada en el paso 2.1.5 en cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 25 μL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Diluya las muestras de plasma/suero 500 veces en tampón de ensayo. Prepare las muestras estándar de acuerdo con la valoración deseada.
- Agregue 12,5 μL de tampón de ensayo como muestra en blanco y agregue cada una de las muestras diluidas o patrón en cada pocillo designado de una placa de muestra de 384 pocillos o 25 μL de la muestra en blanco, diluida o patrón en cada pocillo de una placa de muestra de 96 pocillos.
- Cubra la placa con un sello de aluminio o papel de aluminio e incube durante 1 h a RT en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
nota: En la Tabla 1 se proporciona un esquema de las curvas de dilución.
- Prepare una solución de anticuerpos de detección antihumanos (soluciones de anticuerpos secundarios) a 4 μg/ml con tampón de ensayo como se especifica en el paso 2.1.11.
- Prepare IgM antihumana de cabra, conjugada con anticuerpos de detección de conjugados Super Bright 436 (SB)/IgA antihumana de cabra, ficoeritrina (PE) a 4 μg/mL; o anticuerpos de detección de IgM antihumana de cabra, conjugada SB / IgG antihumana de cabra, PE conjugados a 4 μg/mL.
nota: Para un formato de placa de 384 pocillos, se requieren 12,5 μL/pocillo de la solución de anticuerpo secundario preparada, y para un formato de placa de 96 pocillos, se requieren 25 μL/pocillo.
- Coloque la placa en un separador magnético, lávela rápidamente e inviértala con fuerza sobre un recipiente de riesgo biológico para eliminar el líquido de los pozos. Con el plato aún invertido, golpee con fuerza el plato contra un trozo grueso de papel.
- Lave cada pocillo con 100 μL de tampón de ensayo y elimine el líquido mediante una inversión forzada sobre un recipiente de riesgo biológico, como se describió anteriormente. Repita estos pasos (2.1.12-2.1.13) para un total de dos lavados. Deseche todos los fajos de papel usados en un contenedor de riesgo biológico.
- Agregue 12,5 μL de la solución de trabajo de anticuerpos secundarios a cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 25 μL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con un sello de aluminio o papel de aluminio e incube durante 30 minutos a RT en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
- Repita los pasos de lavado 2.1.12-2.1.13.
- Agregue 75 μL de tampón de ensayo en cada pocillo de una placa de 384 pocillos o 100 μL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con un sello de aluminio o papel de aluminio e incube durante 5 minutos a RT en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
- Analice 60 μL a través del analizador de instrumentos de acuerdo con el manual del sistema.
Tabla 1: Serie de dilución para curvas estándar: Tabla de factores de dilución utilizados para las curvas estándar para el serotipo IgG; presentada como una curva de dilución en serie 1:5 de 7 puntos que comienza en 1 μg/mL para α-Spike S1 y α-Nucleocápside y 5 μg/mL para anticuerpos α-Membrane.
| Número estándar | Serie de dilución | Anti-pico S1 o N (μg/mL) | Antimembrana (μg/mL) |
| espacio en blanco | espacio en blanco | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| número arábigo | STD6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0,008 | 0.04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0.0016 | 0,008 |
| 6 | STD2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
