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1. Colección de organismos
- Recolecta anémona de mar A. dowii.
NOTA: Aquí, los organismos fueron recolectados durante los períodos de marea baja en la zona intermareal frente a la costa de Ensenada Baja, California, México (Figura 1A, B).
- Transportar los organismos al laboratorio en recipientes con agua de mar (Figura 1C).
- En el laboratorio, limpie los organismos con agua destilada a mano para eliminar las grandes partículas de sustrato adheridas al cuerpo.
- Congelar inmediatamente los organismos a -80 °C en un ultracongelador durante 72 h.
- Colocar los organismos en vasos especiales para liofilización, con condiciones de liofilización de -20 °C, 0,015 psi, durante 48 h.
- Almacene los organismos liofilizados a -20 °C hasta su uso.
2. Hidratación de los tejidos
- Reconstituya 20 g de peso seco de organismos liofilizados con 60 mL (1/3 p/v) de tampón de fosfato de sodio de 50 mM, pH 7,5 y 1 tableta de cóctel inhibidor (Tabla de Materiales).
- En un agitador magnético, agite continuamente la muestra a ~800 rpm, 4 °C, durante 12 h.
3. Liberación de toxinas
- Para inducir la lisis celular y la descarga de nematocistos, congele la muestra a -20 °C durante 12 h y luego coloque el recipiente en agua a temperatura ambiente (RT) hasta que se descongele hasta el 90%. Repita este procedimiento tres veces.
nota: La muestra no se descongela al 100%; es crucial mantener la muestra a ~4 °C para evitar la degradación de las proteínas.
- Observe el nematocisto descargado bajo un microscopio confocal. Tome 10 μL de la muestra en un portaobjetos y coloque un cubreobjetos sobre él. Observar bajo un microscopio confocal con aumentos de 100x y 60x. Aquí no era necesario un tinte.
- Procese las imágenes capturadas en el microscopio confocal en el software ImageJ (versión 1.53c, Wayne Rasband, Institutos Nacionales de Salud, EE. UU., https://imagej.nih.gov/ij).
- Si el túbulo dentro del nematocisto se desenrolla y está afuera, los nematocistos se descargan; entonces, continúe con el siguiente paso. De lo contrario, solo realice un ciclo más de congelación y descongelación.
- Para clarificar el extracto, centrifugar la muestra a 25.400 x g durante 40 min, 4 °C, recuperar el sobrenadante y volver a centrifugar. Repita este paso 3-4 veces.
- Recupere el sobrenadante y deseche el pellet. El sobrenadante o extracto crudo contiene los componentes del veneno (toxinas) y otras moléculas celulares, como lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos.
4. Cuantificación de la proteína total
- Determine la concentración de proteína del extracto crudo utilizando un kit comercial de ensayo colorimétrico Bradford (Tabla de materiales).
- Diluya el reactivo de colorante (una parte de tinte con cuatro partes de agua destilada).
- Prepare la solución de fracción V de albúmina sérica bovina (BSA) (tabla de materiales) a una concentración de 1 mg/mL en tampón de fosfato (50 mM de fosfato de sodio, pH 7,5).
- Prepare las soluciones enumeradas en la Tabla 1 por triplicado.
- Mezcle vigorosamente cada solución en un agitador durante 4 s.
- Incubar las muestras durante 5 min a RT, sin agitar.
- Mida la absorbancia (UA) a 595 nm.
- Grafique los promedios de las absorbancias de BSA de la muestra (AU vs. concentración de proteínas) y determine la ecuación del gráfico (Ecuación 1).
donde y es la absorbancia, m es la pendiente de la recta, x es la concentración de proteínas y b es la intersección con el eje y. Para calcular la concentración de extracto crudo, resuelva la x de la siguiente manera:
5. Determinar la complejidad del veneno polipeptídico
- Ensamble el recipiente de vidrio para la electroforesis vertical en gel de acuerdo con el manual.
- Preparar la mezcla de acrilamida (30%): 29,2 g de acrilamida, 0,8 g de bis-acrilamida, el volumen final de 100 mL. Filtre la solución con una membrana de 0,45 μm. Almacene la solución en un frasco oscuro a 4 °C. Luego, prepare la mezcla para el gel resolutivo (Tabla 2).
- El gel SDS-PAGE consta de un gel resolutivo y un gel apilante. Prepare los geles según los volúmenes de solución definidos en la Tabla 2. Durante la preparación, asegúrese de mantener cada mezcla a 4 °C para reducir el tiempo de polimerización.
nota: El volumen de cada mezcla varía en función de la marca del equipo utilizado; para este protocolo, los volúmenes corresponden a la preparación de gel de acrilamida al 15%, de 0,75 mm de espesor, para una cámara de electroforesis vertical (Tabla de Materiales).
- Después de que la acrilamida se haya polimerizado, ~ 10 min, agregue la mezcla de gel apilante.
- Prepare la mezcla para el gel de apilamiento, agréguelo inmediatamente a las placas de vidrio y coloque un peine para formar los pocillos para cargar las muestras.
- Una vez que el gel de apilamiento se haya polimerizado (~15 min), retire el peine y coloque el recipiente de vidrio en una cámara para electroforesis vertical.
- Coloque 200 mL de tampón de electrodo (0,25 M Tris, 0,192 M glicina, 0,1% SDS) en la cámara de electroforesis.
- Analice el extracto crudo: Mezcle 30 μg de extracto crudo con 5 μL de tampón de carga de proteínas (25% de glicerol, 15% de dodecil sulfato de sodio, 25% 2-mercaptoetanol, 0,125 mM Tris pH 7, azul de bromofenol 0,1 mg/mL) para desnaturalizar las proteínas. El volumen final debe ser de <50 μL.
- Calentar a 90 °C durante 5 min, enfriar y centrifugar durante 3 s a 1.400 x g. 10. Cargue las muestras en los pocillos del gel de apilamiento. Cargue una escalera de peso molecular estándar.
- Cargue las muestras en los pocillos del gel de apilamiento. Cargue una escalera de peso molecular estándar.
- Ejecute la electroforesis a una constante de 25 mA durante 1 h 30 min.
- Retire los recipientes de vidrio de la cámara de electroforesis para proceder a la tinción de las proteínas en gel.
6. Tinción de proteínas
- Enjuague el gel con 50 ml de agua destilada para eliminar los residuos del electrodo tampón.
- Deseche el agua.
- Para evitar la difusión de las proteínas del gel, añadir la solución de fijación (60 mL de etanol, 20 mL de ácido acético y 20 mL de agua destilada, volumen final 100 mL). Incubar en RT durante 40 min con agitación a 80 rpm. Decanta la solución.
- Añadir la solución de reticulación de proteínas (15 mL de etanol, 0,25 mL de glutaraldehído, 50 mL de agua destilada, volumen final 65,25 mL), e incubar durante 30 min a RT con agitación a 80 rpm. Retira la solución.
- Lavar el gel con 100 mL de agua destilada durante 5 min, y retirar el agua. Repita este procedimiento cuatro veces.
- Realizar la tinción de proteínas con 50 mL de solución filtrada azul brillante R-250 de Coomassie (40% de metanol, 10% de ácido acético, 50% de agua destilada, 0,1% de colorante, volumen final de 100 mL), agitando a 60 rpm en un oscilador rotativo de laboratorio a RT durante 15 min.
- Recupera la solución, que se puede utilizar para teñir otros geles.
- Para eliminar el exceso de colorante, agregue una solución decolorante (40 mL de metanol, 10 mL de ácido acético, 50 mL de agua destilada). Siga removiendo (80 rpm) a RT hasta que se visualicen las bandas (proteínas teñidas).
- Mantenga el gel en 50 ml de agua destilada y escanee la imagen en un sistema de documentación de gel.
7. Ensayo de fosfolipasa
- Lave un huevo de gallina con una FDS al 1% en agua destilada.
- Separe la yema de huevo de la clara de huevo en condiciones estériles.
- Prepare 50 ml de solución de NaCl al 0,86% y filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Luego, prepare la solución A: Agregue 12 mL de yema de huevo y 36 mL de solución de NaCl al 0,86%.
- Preparar la solución B: Mezclar 300 mg de agarosa en 50 mL de tampón (50 mM Tris, pH 7,5), filtrar a través de un filtro de 0,22 μm. Calienta la solución en el microondas hasta que hierva. Enfriar en agua tibia hasta alcanzar los 43-45°C.
- Prepare la solución C: Prepare 10 mM de CaCl2 y fíltrelo con un filtro de 0,22 μm.
- Preparar Solución D: 10 mg de rodamina 6G en 1 mL de agua destilada.
- En condiciones estériles (campana de flujo laminar), agregue 500 μL de soluciones A y C a la solución B y 100 μL de solución D, mezcle y vierta 25 mL en cada placa de Petri (90 x 15 mm).
- Espere a que la solución se solidifique en condiciones estériles (30 min).
- Haga pozos (~2-3 mm de diámetro) con un tubo delgado.
- Agregue un total de 20 μL de tampón de fosfato (control negativo) en un pocillo y 20 μL de una fosfolipasa determinada (control positivo) en otro pocillo.
- Coloque diferentes cantidades de la proteína del extracto crudo, 5, 15, 25, 35, 45 μg, en los pocillos restantes, cada uno en un volumen final de 20 μL.
- Espere a que el agar adsorba todas las muestras (30 min).
- Incubar a 37 °C durante 20 h.
- Si se forma un halo alrededor del pozo, esto indica actividad de fosfolipasa. Mida el halo formado con un calibrador vernier.
nota: Realice el experimento por triplicado (pasos de 7.1 a 7.14).
