1. Fabricación de sellos de polidimetilsiloxano (PDMS)
- Dibuje una matriz de anillos a microescala utilizando software CAD, con un diámetro interior de 250 μm y un diámetro exterior de 450 μm. El patrón utilizado en este protocolo es una matriz de 10 x 10 con una distancia de 850 μm entre anillos.
- Imprima una máscara de transparencia del patrón a la resolución deseada utilizando el servicio de impresión de máscaras de una empresa de microfabricación (ver Tabla de Materiales).
nota: Se ha demostrado que las dimensiones proporcionadas del anillo funcionan para muchos tipos de células.
- Realice fotolitografía ultravioleta (UV) utilizando la máscara que contiene las características deseadas para hacer un molde fotorresistente negativo (como SU-8).
- Cubra una oblea de silicona recubierta de centrifugado con fotorresistencia mediante la máscara de transparencia fabricada en los pasos 1.1-1.2.
- En un alineador de contacto UV, polimerice la fotorresistencia debajo de las regiones transparentes de la máscara con luz UV.
nota: Después de un lavado y desarrollo adicionales, se fabrica el molde maestro con las características deseadas. Los detalles operativos dependen del equipo específico utilizado.
- Prepare los prepolímeros elastoméricos PDMS mezclándolos con su agente de curado en una proporción de 10:1 y luego vierta la mezcla en el molde en una placa de Petri.
- Coloque el plato en una cámara de vacío durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire en PDMS y hornee en un horno a 60 °C durante al menos 2 h.
- Después de completar el curado de PDMS, corte las matrices de patrones en sellos.
nota: Se pueden preferir sellos más gruesos (aproximadamente 1 cm) debido a la facilidad de manejo en los pasos posteriores de la impresión por microcontacto.
2. Recubrimiento de portaobjetos de vidrio
- Limpie los portaobjetos de vidrio. Remoje los portaobjetos en un baño de etanol 100%, sonique durante 5 minutos y luego enjuague con agua.
- Repita este paso primero con acetona, luego con isopropanol, seguido de un secado en un chorro de nitrógeno.
- Utilice un equipo de evaporación por haz de electrones (E-beam) para recubrir capas de titanio y oro en portaobjetos de vidrio.
nota: Para la capa de titanio, el espesor deseado es de 15 Å (1 Å = 10-10 m). Para la capa de oro, el grosor deseado es de 150 Å. Cubra primero el titanio y luego el oro, ya que la capa de titanio sirve como adhesivo entre el oro y la corredera de vidrio.
- Coloque los portaobjetos limpios en la cámara de evaporación e inserte crisoles de oro y titanio debajo de las persianas.
- Bombee hacia abajo la cámara para crear un vacío inferior a 10-5 Pa antes de derretir los metales. Enfoque el haz de electrones en el metal y ajuste la potencia para que la tasa de depósito sea adecuada para controlar el espesor de deposición.
- Abra el obturador para iniciar la deposición del metal. Cierre el obturador cuando se alcance el grosor deseado.
- Alterna los crisoles entre la evaporación secuencial de dos metales.
- Espere a que los crisoles se enfríen según lo requiera el equipo, ventile la cámara y saque las correderas de vidrio recubiertas de oro.
- Bombee la cámara nuevamente para el mantenimiento del equipo.
nota: Los detalles operativos pueden depender de un evaporador de haz E específico. Es importante tener una tasa de depósito de titanio baja y bien controlada. Una capa gruesa de titanio a menudo conduce a una mala visibilidad, especialmente para las imágenes de fluorescencia de las células. Después del recubrimiento, los portaobjetos de vidrio recubiertos de titanio/oro se pueden almacenar en una cámara de vacío seco a temperatura ambiente durante al menos 1 mes.
3. Impresión por microcontacto
- Corta la corredera recubierta de titanio/oro en pedazos más pequeños, si lo deseas. Se recomienda una forma cuadrada de 12 mm x 12 mm para una aplicación típica (Figura 1B).
- Use un cortador de vidrio para deslizarse por la superficie y dejar una huella abollada, luego sostenga el portaobjetos de vidrio a ambos lados y dóblelo en la abolladura para romperlo en cuartos pequeños. Evite tocar la superficie recubierta de oro.
nota: Para determinar visualmente qué lado del vidrio es la superficie recubierta en caso de vuelco accidental, compare el reflejo de la luz en ambos lados. La superficie cubierta de oro mostrará un reflejo más brillante, mientras que el lado no recubierto tendrá un reflejo más tenue (de la capa de titanio en el otro lado del vidrio). Una forma alternativa es observar los bordes de la corredera, y el lado del recubrimiento se puede determinar a partir de la superficie de corte vertical.
- Limpie los portaobjetos sumergiéndolos en etanol al 100% en una placa de Petri con el lado dorado hacia arriba en un agitador orbital durante al menos 10 minutos. Aspire el etanol, luego seque cada portaobjetos soplando con un chorro de nitrógeno.
- Limpie los sellos PDMS con agua jabonosa y luego con etanol al 100%. Secar los sellos con gas nitrógeno.
- Prepare una solución de 2 mM de octadecanetiol (C18) disolviendo 5,74 mg de polvo de C18 en 10 mL de etanol al 100%
nota: Selle y almacene la solución de C18 a temperatura ambiente. Los patrones de impresión con C18 crean una monocapa adhesiva autoensamblada a la que se unirán preferentemente la fibronectina y las células.
- Remoje los sellos PDMS en solución C18 con la superficie estampada hacia abajo durante 10 s y seque suavemente con gas nitrógeno durante 60 s.
nota: Al secar, coloque el chorro lejos del sello primero (aproximadamente 1 m) hasta que se evapore la mayor parte del líquido y luego acerque lentamente el chorro para secar completamente el sello. Esto es para evitar que la solución de C18 se lleve por el viento en lugar de secarse en el sello.
- Coloque el sello boca abajo sobre las correderas doradas durante 60 s antes de retirarlo.
- Para asegurar un estampado adecuado, golpee suavemente las pinzas sobre los sellos para transferir correctamente los patrones. No empuje hacia abajo con demasiada fuerza, y el peso de las pinzas suele ser suficiente.
nota: La inspección visual del sello durante el golpeteo asegurará que el sello y la corredera de vidrio hayan entrado en contacto de manera uniforme.
- Prepare las cámaras de humedad.
- Pipetee 1 mL de etanol al 70% en la tapa de una placa de Petri invertida y coloque un trozo de parafilm para cubrir la superficie (cubierta boca arriba).
- Use pinzas para levantar, coloque el parafilm para asegurarse de que no haya burbujas de aire y elimine el exceso de etanol si es necesario.
- Prepare 2 mM de solución HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3): Diluir 5 μL de solución madre en 5 mL de etanol al 100%
nota: La solución de EG3 diluida puede sellarse y almacenarse a 4 °C, y el caldo de EG3 sin diluir debe almacenarse a -20 °C. El tratamiento EG3 se utiliza para hacer que la región del vidrio sin C18 no sea adherente a las células.
- Micropipeta 40 μL de gotas de EG3 por cada cuarto de vidrio que se deslizan sobre el parafilm en la cámara de humedad, dejando suficiente espacio entre gotas para tener en cuenta el espaciado de los portaobjetos de oro.
- Use pinzas para colocar las diapositivas de oro impresas en C18 boca abajo sobre las gotas y asegúrese de que no haya burbujas debajo de las diapositivas. Empuje suavemente los portaobjetos sin levantarlos para minimizar la evaporación.
nota: Coloque un borde del vaso que se deslice hacia abajo cerca de la gota y luego, bajando lentamente el otro extremo del vaso, deslícese hacia abajo. Si hay una burbuja presente, empuje la corredera dorada sin levantarla hasta que la burbuja ya no esté presente.
- Selle herméticamente la placa de Petri con parafilm y déjela a temperatura ambiente durante al menos 3 h.
nota: Si se desea una incubación extensa, selle dos veces la placa de Petri y déjela hasta 24 h.
- En un gabinete de bioseguridad, coloque los portaobjetos de oro boca arriba en una placa de Petri, remoje y enjuague 3 veces en etanol al 70% para eliminar EG3, luego déjelo en etanol durante 10 minutos para su esterilización.
- Aspire el etanol y reemplácelo con PBS estéril.
- Prepare otra cámara de humedad como se describe en el paso 3.9, con PBS en lugar de etanol.
nota: Debido a la diferencia en la tensión superficial, es más fácil agregar primero 4-5 mL de PBS para colocar el parafilm y eliminar las burbujas, luego aspirar el exceso.
- Prepare la solución de fibronectina de 50 μg/mL (otras proteínas, si lo desea) en PBS estéril y micropipete, se deslizarán 50 μL de gotas de solución de fibronectina por cada cuarto sobre el parafilm, dejando algo de espacio entre gotas><.
nota: El recubrimiento de fibronectina facilita la adhesión de las células a las superficies estampadas.
- Use pinzas de oblea para colocar los portaobjetos boca abajo sobre las gotas y asegúrese de que no haya burbujas debajo de los portaobjetos. Empuje suavemente las correderas sin levantarlas.
nota: Se recomiendan pinzas de vidrio para portaobjetos o pinzas de oblea con puntas rectas y anchas para manipular los portaobjetos.
- Deje la placa de Petri en el gabinete de bioseguridad durante 30 min.
- Después de 30 minutos, coloque las diapositivas doradas boca arriba en PBS después de enjuagar 3 veces.
nota: Los portaobjetos con patrón de fibronectina pueden almacenarse en PBS a 4 °C durante aproximadamente un mes.
4. Sembrar células en portaobjetos micropatrones
- Calentar los medios de cultivo celular y la tripsina en un baño de agua a 37 °C.
nota: La siguiente descripción del subcultivo corresponde a las células NIH/3T3. Las condiciones de cultivo pueden variar según el tipo de célula.
- (Opcional) Remoje los portaobjetos con patrones en medios de cultivo en una placa de 12 pocillos, caliéntelos hasta 37 °C en una incubadora antes de la tripsinización de las células para una mejor adhesión de las células.
- Tripsinizar las células, neutralizar con medios que contengan FBS, centrifugar a 100 x g durante 3 minutos y luego resuspender mezclando bien con medios frescos.
nota: Asegúrese de que las celdas estén completamente disociadas entre sí.
- Cuente las células, diluya hasta 200.000 células/mL y añada 0,5 mL de la suspensión celular a cada pocillo que contenga un portaobjetos de oro.
- Agite suavemente la placa del pocillo unas cuantas veces para obtener una siembra uniforme de células y guárdela en una incubadora durante 15 minutos para permitir la adhesión de las células.
- Después de 15 minutos, revise la unión de la célula bajo un microscopio. Permita tiempo adicional, si es necesario.
nota: Las células adheridas se extenderán en la superficie con filopodio visible o aplanamiento y no se moverán de la superficie cuando la placa del pozo se golpee o mueva suavemente.
- Aspire el medio que contiene células no adheridas de cada pocillo y agregue 1 mL de medio de cultivo. Para el tratamiento farmacológico, suplementar los reactivos adicionales a los medios de cultivo en este paso.
- Cultive las células en la incubadora durante 24 h y verifique la confluencia para determinar si se ha formado quiralidad><.
nota: Se recomienda una confluencia superior al 75% para la mayoría de los tipos de células, y la sobreconfluencia puede afectar a la caracterización de la quiralidad.
5. Colección de imágenes
- Fija las celdas en la confluencia.
- Retire los medios de cultivo de la placa de pocillos y enjuague una vez con PBS.
- Agregue una solución de paraformaldehído al 4%, incube a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego enjuague 3 veces con PBS.
NOTA: Si la fijación cambia significativamente la morfología celular, se recomienda la toma de imágenes antes de la fijación
- Utilice un microscopio de contraste de fase con función de cámara, tome imágenes de cada anillo en los portaobjetos a alta resolución (la lente de objeto de 10x es suficiente para el análisis).
>6. Caracterización de la quiralidad celular (Figura 2)
- Descargue archivos de código de MATLAB para la caracterización de quiralidad.
- Agregue la carpeta de código y las subcarpetas (con la caja de herramientas de estadísticas circulares dentro) a la ruta de MATLAB y abra el archivo "ROI_selection.m". En la línea 4, cambie el directorio a la carpeta de datos deseada (para los usuarios de ventanas, cambie "/" por "\" en las líneas 4 y 5).
- Cambie el tamaño de la imagen en la línea 14, con las dos primeras cifras representando el tamaño del círculo interior del anillo mientras que las otras dos representan el exterior.
nota: Asegúrese de que los tamaños de todas las imágenes de una carpeta que se va a analizar sean idénticos.
- Haga clic en el botón Run para ejecutar el código de MATLAB "ROI_selection.m" para determinar la región de interés (ROI) en las imágenes de contraste de fase.
- Arrastre manualmente el cuadrado de selección para que quepa en el anillo, luego haga doble clic en la imagen para confirmar la selección.
- Repita este paso para cada imagen en la carpeta (la siguiente imagen aparecerá automáticamente después de confirmar la selección de ROI de una imagen anterior); se generará un archivo ".mat" para almacenar la información de ROI para cada imagen.
- Abra el archivo "Analysis_batch.m" y cambie el directorio de la carpeta igual que en el paso 6.2. (Para los usuarios de Windows, para el uso por primera vez, cambie "/" por "\" en las líneas 5, 6, 124 y 130)
- Haga clic en el botón Ejecutar para ejecutar el código "Analysis_batch.m" para determinar la quiralidad de múltiples patrones de anillo celular. Se generará un archivo "datatoexcel.txt", que contiene estadísticas circulares para cada anillo, así como los números de anillos en el sentido de las agujas del reloj, no quirales y en sentido contrario.
