Ensayo de captación de vesículas extracelulares: un método para visualizar y cuantificar la captación celular de vesículas extracelulares mediante la técnica de imágenes de fluorescencia 3D

Abstract

Fuente: Kim, C. J., et al., Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes de microscopio confocal. J. Vis. Exp. (2022).

En este video, demostramos un ensayo para visualizar y cuantificar la absorción celular de vesículas extracelulares o EV. Este ensayo utiliza imágenes fluorescentes en 3D utilizando un microscopio confocal y permite distinguir los EV internalizados de los adheridos a la superficie celular.

Protocol

1. Aislamiento de vehículos eléctricos y etiquetado de vehículos eléctricos inmunofluorescentes en chip

1. Recolección de medios de cultivo celular (CCM) y preprocesamiento de CCM para el aislamiento de EV
   1. Siembre células PC3 al 30% de confluencia en un matraz de cultivo celular de 75^cm2. Permitir que las células de control crezcan hasta un 90% de confluencia (~48 h) en medios estándar y suplementos específicos de líneas celulares.
      nota: Para evitar que los componentes que contienen EV afecten la absorción celular (es decir, suero fetal bovino), use medios y suplementos con exosoma empobrecido.
   2. Cosecha el MCP.
   3. Centrifugue el CCM a 1000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) para granular cualquier celda no adherida y desechos grandes recolectados con el medio. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico.
   4. En el nuevo tubo, centrifugue el sobrenadante a 10.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para granular los residuos más pequeños y los cuerpos apoptóticos que quedan en el medio. Algunos vehículos eléctricos más grandes harán pellets. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
   5. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de membrana de fluoruro de polivinilideno hidrofílico (PVDF) de 0,45 μm.
      nota: Si no procesa inmediatamente el CCM para el aislamiento de EV, almacene el CCM preprocesado a -80 °C hasta que se realice el aislamiento. Si está congelado, limite los ciclos de congelación y descongelación a uno.
2. Aislamiento de EV de CCM mediante un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración
   1. Si está congelado, descongele completamente el CCM y el vórtice durante 30 s antes del paso 1.2.2.
   2. Inyecte 1 mL de CCM preprocesado (paso 1.1) en la cámara de muestras del dispositivo microfluídico basado en nanofiltración (ver Tabla de Materiales).
      nota: Siga el procedimiento operativo estándar para el dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.
   3. Gire a 3000 rpm durante 10 min en la máquina de hilar de sobremesa (consulte la tabla de materiales) para operar el dispositivo microfluídico.
      nota: Si el MCP permanece en la cámara de muestras después de la ejecución inicial, realice giros adicionales hasta que todos los MCC se hayan vaciado de la cámara de muestras.
   4. Retire el líquido de la cámara de residuos pipeteando y repita los pasos 1.2.1, 1.2.2 y 1.2.3 dos veces.
      nota: En total, se procesarán 3 mL de CCM para el aislamiento de EV.
   5. Inyecte 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la cámara de muestras para lavar los EV aislados. Gire en la máquina de hilar de sobremesa para operar el dispositivo microfluídico como se mencionó en el paso 1.2.3. Ubique los EV puros en la membrana del dispositivo.
      nota: En la investigación previa, se confirmó y comparó la calidad de los VE aislados del dispositivo microfluídico basado en nanofiltración y se comparó con el método convencional de UC mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopio electrónico de barrido (SEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), microscopía de iluminación estructurada, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas y PCR en tiempo real.
3. Marcaje inmunofluorescente de EV mediante un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración (Figura 1)
   1. Seleccione un anticuerpo específico para EV de acuerdo con el propósito del ensayo (ver Tabla de Materiales).
      nota: Ciertos anticuerpos pueden interferir con los sitios de unión al ligando específicos de las vías de captación de EV (es decir, endocitosis).
   2. Inyecte 1 μg/mL del anticuerpo específico de EV en el orificio de elución del dispositivo que contiene 100 μL de EV aislados.
   3. Incubar durante 1 h en la oscuridad a RT en un agitador de placas para garantizar la distribución uniforme del anticuerpo en la muestra.
   4. Coloque una cinta adhesiva en el orificio de elución. Inyecte 1 mL de PBS en la cámara de muestras para eliminar los anticuerpos residuales.
   5. Gire el dispositivo a 3000 rpm hasta que la cámara de muestras esté vacía. Retire cualquier líquido de la cámara de residuos mediante pipeteo. Inyecte 1 mL de PBS en la cámara de muestras.
      nota: Los vehículos eléctricos marcados con fluorescencia se ubicarán en la cámara de membrana.
   6. Pipetear los EV marcados con fluorescencia (Figura 2) desde la cámara de membrana hasta un tubo ámbar. Bloquee de la luz hasta su uso.

2. Incubación de las células con EVs marcados con fluorescencia para el ensayo de captación de EV

1. Siembra y cultivo de células objetivo en las placas compatibles con el cultivo celular.
   1. Siembre 1 x 10^{4 células} PC3 en la placa de microportaobjetos de 8 pocillos (9,4 x 10,7 mm para cada pocillo) con 0,2 mL de medio o 4 x 10⁴ células PC3 en un plato de 35 mm con 1 mL de medio. Coloque las células en una placa compatible con el cultivo celular que consista en un cubreobjetos delgado (grosor: 0,18 mm).
      nota: El fino cubreobjetos minimiza la dispersión adversa de la luz.
   2. Permitir que las células se adhieran durante la noche en condiciones óptimas de cultivo celular (37 °C, 5% de concentración de CO₂, 90% de humedad).
   3. Lave las células adheridas dos veces con medios empobrecidos en exosomas (descrito en el paso 1.1.1).
2. Incubación celular con VE marcados con fluorescencia.
   1. Mida la concentración de VE marcados con fluorescencia (paso 1.3.5) mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, Figura 3). Determinar la concentración óptima de VE marcadas con fluorescencia que se añadirán a las células cultivadas (paso 2.1.2.).
   2. Diluya los VE marcados con fluorescencia con medios empobrecidos en exosomas para que coincidan con la concentración deseada medida en el paso 2.2.1. (es decir, 7,80 x 10⁹ EV (en valor NTA) en 200 μL de medios empobrecidos en exosomas).
   3. Añadir los EV diluidos (paso 2.2.2) a las células diana adheridas preparadas en el punto 2.1.2. Incubar durante el tiempo experimental (es decir, 4, 8 o 12 h).
   4. Lave las células tres veces con medios libres de exosomas para eliminar cualquier EV no internalizado.
      nota: Opcional: Las celdas se pueden fijar después del lavado.
   5. Marcar el citoplasma de las células adheridas con 1 μg/mL de CMTMR ((5-(y-6)-(((4-clorometil)benzoil)amino) tetrametilrodamina) (ver Tabla de Materiales) e incubar en condiciones óptimas de cultivo celular (37 °C, 5% de concentración de CO₂, 90% de humedad)
      nota: Los tintes de área celular deben emitir fluorescencia por separado de los VE marcados para ayudar a determinar la ubicación espacial (internalizada o superficial) de los EV con picos durante el ensayo de absorción de EV.
   6. Lave las células marcadas dos veces con medios empobrecidos en exosomas para eliminar el tinte residual. Agregue medios nuevos empobrecidos en exosomas a las células en preparación para la obtención de imágenes confocales de células vivas.

3. Microscopía confocal

1. Para realizar imágenes de células vivas, utilice una incubadora en el escenario para mantener las condiciones óptimas de cultivo celular (37 °C, 5% de concentración de CO₂, 90% de humedad).
2. Coloque las células preparadas en la incubadora de la plataforma.
3. Establezca los parámetros de imagen en función de las muestras de control.
   nota: Las muestras de control sugeridas incluyen: VE marcadas con fluorescencia solamente, células marcadas con fluorescencia, VE sin marcar y células sin marcar.
4. Determine la profundidad de las celdas objetivo y el rango de tamaño de apilamiento en la dirección z para adquirir imágenes confocales 3D.
   nota: El grosor de una pila Z es de 1 μm. La adquisición de imágenes confocales en 3D duró 2 minutos y 34 segundos (cada adquisición de imágenes en el plano Z duró aproximadamente 8 segundos; un total de veinte imágenes en pila Z).
5. Establezca la adquisición de imágenes en varias imágenes apiladas en z de colorante específico de la célula (es decir, rojo) y colorante específico de EV (es decir, verde) simultáneamente (Figura 4 y Figura 5A).

4. Procesamiento de imágenes

1. Utilice software de procesamiento automático de imágenes para analizar las imágenes confocales sin procesar apiladas en Z y determinar la absorción de EV por las células (consulte la Tabla de materiales).
2. Establezca los parámetros de umbral para la señal fluorescente de las células y los tintes específicos de EV. Construya las superficies virtuales de las celdas (Figura 5A,B).
   1. Para construir las superficies virtuales de las celdas, haga clic en el botón Agregar nuevas superficies.
   2. Seleccione Cálculo de distancia más corta como "Configuración del algoritmo" para utilizar el algoritmo proporcionado por el software, luego haga clic en Siguiente: Canal de origen.
   3. Seleccione Canal 2 - CMTMR como "Canal de origen" en este experimento.
   4. Seleccione Suavizar y ponga el valor apropiado en "Detalle de superficies" para suavizar superficies.
      NOTA: 0,57 μm en este experimento, ya que 1 píxel representa 0,57 μm en datos de imagen sin procesar.
   5. Seleccione Intensidad absoluta como "Umbral".
   6. Para umbralizar automáticamente la imagen fluorescente mediante el algoritmo proporcionado, haga clic en Umbral (intensidad absoluta): el valor se establece automáticamente.
   7. Seleccione Habilitar como "Dividir objetos táctiles (región creciente)" y coloque el valor del tamaño de celda estimado en "Diámetro de puntos de semilla", 10,0 μm en este experimento. A continuación, haga clic en Siguiente: Filtrar puntos semilla.
   8. Para configurar las superficies de celda virtual, haga clic en el botón + Agregar y, a continuación, seleccione Calidad como "Tipo de filtro". Establezca el umbral del valor adecuado (210 en este experimento) para el límite inferior mediante una inspección visual y el valor máximo (1485) para el límite superior y, a continuación, haga clic en el botón Finalizar.
      nota: Una inspección visual significa que un investigador puede discriminar el área celular de una imagen fluorescente en bruto.
   9. A continuación, para construir los puntos virtuales de los EV, haga clic en el botón Agregar nuevos puntos.
   10. Seleccione Diferentes tamaños de punto (región creciente) y Cálculo de distancia más corta como "Configuración del algoritmo" y, a continuación, haga clic en Siguiente: Canal de origen.
   11. Seleccione el canal 1 - Alexa Fluor 488 como "Canal de origen" en este experimento.
   12. Ponga el valor apropiado en "Diámetro XY estimado" para la detección puntual, 1 μm en este experimento. A continuación, haga clic en Siguiente: Filtrar puntos.
   13. Para configurar los puntos EV virtuales, haga clic en el botón + Agregar, seleccione Calidad como "Tipo de filtro" y establezca "Umbral inferior" mediante una inspección visual, 100 en este experimento. A continuación, haga clic en el botón Siguiente: Tipo de región de spot.
   14. Seleccione Intensidad absoluta como "Tipo de regiones puntuales" y, a continuación, haga clic en Siguiente: Regiones puntuales.
   15. Para el umbral, la región de los puntos EV, coloque el valor apropiado en "Umbral de región" mediante una inspección visual, 100 como "Umbral de región" en este experimento.
       nota: Una inspección visual significa que un investigador puede discriminar el área de los EV a partir de una imagen fluorescente en bruto.
   16. Selecciona "Volumen de región" como "Diámetro desde" y, a continuación, haz clic en Finalizar.
3. Utilice los algoritmos proporcionados por el software para dividir los puntos agrupados dentro de la superficie construida en el paso 4.2 (Figura 5C, i-iv).
   1. Haz clic en las Puntuales integradas y, a continuación, ve a Filtros.
   2. Haga clic en el botón + Añadir, seleccione Distancia más corta a las superficies Superficies = Superficie 1 como Tipo de filtro y, a continuación, haga clic en el botón Duplicar selección en nuevas plazas. El umbral más bajo (-7,0 en este experimento) para el límite inferior y el valor apropiado (-0,5) para el límite superior.
      nota: Establezca el límite superior con el radio estimado de las manchas. En este experimento, el diámetro estimado de los puntos, es decir, los puntos EV, se estableció en 1 μm en el paso 4.2.11.; Por lo tanto, el límite superior puede ser 0,5.
4. Conteo automático de EVs dentro de las celdas
   nota: El software contará automáticamente el número de EV dentro de las celdas, indicando el número internalizado por las celdas objetivo.
   1. Haga clic en la selección de Puntos 1 construidos [Distancia más corta a las superficies: Superficies = Superficies 1 entre -7,00 y -0,500].
   2. Vaya a las Estadísticas y exporte el valor de "Número total de lugares"
      nota: Los algoritmos proporcionados por el software calcularán automáticamente el número y el volumen de celdas.
5. Determine el rendimiento de absorción de EV por período de incubación en función de los valores calculados anteriormente (Figura 6).
   1. Para obtener el número de celdas, haga clic en las Superficies construidas 1, luego vaya a las Estadísticas y exporte el valor de "Número total de superficies" desde General.
   2. Vaya a Detallado en Estadísticas para exportar el Volumen desde Detallado.

Results

Figura 1: Ilustración esquemática del aislamiento de EV y el etiquetado en chip utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración. (A) Aislamiento de EV de CCM. (B) Marcaje inmunofluorescente en chip de vehículos eléctricos. (C) Eliminación de anticuerpos no unidos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-humano Anticuerpo CD63	Bioleyenda	353038	Tinte fluorescente conjugado anticuerpo específico EV
Tinte CellTracker Naranja CMTMR	Thermo Fisher Scientific	C2927	Reactivo de marcaje con fluorescente de célula viva (citoplasma)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objetivo para la imagen confocal, NA=1,25
Plan CFI Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objetivo para la imagen confocal, NA=0,75
Exodisco	Labspinner Inc.	EX-D1001	Un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración para el aislamiento de vehículos eléctricos
ExoDescubrimiento	Labspinner Inc.	EX-R1001	Dispositivo de operación para Exodisc
FBS empobrecido en exosomas	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutriente de medios de cultivo celular para la recolección de EV derivados de líneas celulares PC3
Suero fetal bovino (FBS)	VWR	1500-500	Nutriente para el cultivo celular
Cabra Anti-Ratón IgG H&L preadsorbido	ABCAM	AB7063	Anticuerpo IgG de ratón para el control negativo del marcaje EV
Ibidi USA U DISH μ-Plato 35 mm	Ibidi	81156	Placa de cultivo para la obtención de imágenes confocales
Imaris 9.7.1	Instrumentos Oxford	9.7.1	Software de procesamiento posterior a imágenes
Sistema de incubadora+ mezclador de gas CO2/O2/N2	Instrumento de célula viva	TU-O-20	Sistema de incubación para la obtención de imágenes de células vivas
Cámara Nikon A1 HD25 / A1R HD25	Nikon	Na	Cámara para imágenes confocales
Microscopio Nikon Eclipse Ti	Nikon	Na	Microscopio invertido para la obtención de imágenes confocales
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Software de procesamiento de imágenes para microscopio Nikon
NTA, NanoSight NS500	Malvern Analítica	NS500	Dispositivo de medición de la concentración de EV
OriginPro 2020	Laboratorio de origen	9.7.0.185	Software de gráficos
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibióticos para el cultivo celular
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Medios de cultivo celular para el cultivo de líneas celulares PC3
SYTO RNASelect Tinción de célula fluorescente verde - Solución de 5 mM en DMSO	Thermo Fisher Scientific	S32703	Tinción de ARN con colorante fluorescente para el marcaje