El ensayo de captura de partículas similares a virus: un método para aislar VLP que muestran antígenos de una muestra utilizando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos neutralizantes

Resumen

Fuente: Rosengarten, J. F., et al. Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) mediante un ensayo de captura. J. Vis. Exp. (2022).

En este video, demostramos un ensayo de inmunoprecipitación, llamado ensayo de captura VLP, para aislar partículas similares a virus que muestran antígenos, o VLP, de una muestra. El antígeno se une a anticuerpos específicos unidos a perlas magnéticas, formando un complejo antígeno-anticuerpo inmovilizado que luego se separa y almacena para su posterior análisis.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Siembre las líneas celulares de suspensión productoras de VLP derivadas de células 293-F que expresan genes estructurales del VIH solas o en concierto con env a una baja densidad celular de 0,5 x 10⁶ células por ml en un medio de expresión 293-F.
2. Déjelos expandirse durante 3-4 días a 37 °C y 8% de CO₂ en una rotación de incubadora agitadora con una órbita de 5 cm y 135 rondas por minuto (rpm).
3. Granular las células productoras por centrifugación a 100 x g durante 5 min. Filtrar el sobrenadante clarificado para eliminar las células residuales y los restos celulares utilizando filtros de jeringa de membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm para obtener un sobrenadante de cultivo celular libre (CFSN).
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. El CFSN puede almacenarse durante la noche a 4 °C.
4. Utilice el CFSN directamente para el experimento o granule VLP de 35 mL de CFSN empleando ultracentrifugación (112.700 x g, 4 °C, 1,5 h).
5. Tras la ultracentrifugación, deseche el sobrenadante y suspenda los gránulos de VLP en 200 μL de solución de trehalosa al 15% (p/v) por tubo de centrífuga.
   NOTA: El pellet VLP a menudo no es visible a simple vista. El protocolo se puede pausar aquí. Las VLP se pueden almacenar a –80 °C.
6. Antes del ensayo de captura de VLP, determine las concentraciones de proteínas del núcleo viral en las muestras que contienen VLP utilizando un ELISA. Este paso es importante para estandarizar la entrada del ensayo de captura.

2. Ensayo de captura VLP

NOTA: En la Figura 1 se muestra una descripción general del flujo de trabajo.

1. Suspenda las perlas magnéticas pipeteando hacia arriba y hacia abajo o mezclando en un rotor a 50 rpm durante al menos 5 minutos.
2. Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpos que contiene los bNAbs. Utilice 10 μg de cada bNAb en 200 μL de tampón de unión y lavado de anticuerpos (ver Tabla de Materiales) por reacción.
   NOTA: Las cantidades de anticuerpos pueden variar en función de la afinidad del bNAb y de la densidad de decoración del antígeno en las VLP utilizadas.
3. Utilice 50 μL de la solución magnética de perlas (consulte la Tabla de materiales) por reacción y transfiera las perlas a un tubo de reacción de 1,5 mL. Coloque los tubos en la rejilla de separación magnética.
   NOTA: Alternativamente, se puede usar un solo imán fuerte para cada tubo para separar las perlas del sobrenadante.
4. Espere unos minutos hasta que las cuentas se junten en la pared del tubo para asegurarse de que se recojan todas las cuentas. Retire el sobrenadante.
5. Retire el imán y suspenda las perlas en 200 μL de la solución de bNAb preparada en el paso 2.2. Incubar durante 30 min a 3 h mezclando en un rotor a 50 rpm a temperatura ambiente.
6. Vuelva a colocar los tubos de reacción en la rejilla de separación magnética, espere y retire el sobrenadante.
7. Retire los tubos del imán y lave las perlas volviendo a suspender 200 μL de tampón de unión y lavado de anticuerpos.
8. Repita el paso 2.4. Retire la mayor cantidad posible de tampón de lavado.
9. Agregue las muestras a la carpeta bNAbs.
   NOTA: La entrada de VLP para el ensayo de captura con partículas derivadas del VIH debe ser de al menos 15 ng de proteína central viral por reacción. Las cantidades de VLP pueden variar en función de la afinidad del bNAb y de la densidad de decoración del antígeno en las VLP utilizadas.
10. Si el volumen de la muestra añadido en el paso 2.9 es inferior a 1 mL, añada PBS para ajustar el volumen de la muestra a 1 mL. Suspenda las perlas suavemente pipeteando.
11. Incubar las muestras y las perlas durante 2,5 h en un rotador a temperatura ambiente. Asegúrese de que las perlas permanezcan en suspensión y que la solución se mezcle completamente durante la incubación.
12. Coloque los tubos en el imán y retire el sobrenadante.
13. Lave las perlas magnéticas suspendiéndolas en 200 μL de tampón de lavado (consulte la tabla de materiales). Repita el paso de lavado tres veces.
14. Suspenda las perlas en 100 μL de tampón de lavado y transfiera la suspensión a un tubo de reacción limpio (resistente al calor).
15. Coloque el tubo en la rejilla de separación magnética (consulte la tabla de materiales) y retire el sobrenadante por completo.
16. Prepare muestras SDS-PAGE desnaturalizadas siguiendo los pasos 2.16.1-2.16.2 o muestras no desnaturalizadas eluyendo las VLP de las perlas magnéticas siguiendo los pasos 2.16.3-2.16.5.
    1. Para preparar muestras desnaturalizadas de SDS-PAGE, suspenda las perlas en 20-80 μL de tampón Laemmli (0,8 μL de tampón Laemmli por 1 ng de entrada de ensayo p55 Gag) e incube a 95 °C durante 5 min.
    2. Proceda directamente con SDS-PAGE o almacene las muestras a -20 °C.
       PRECAUCIÓN: El tampón Laemmli contiene 2-mercaptoetanol y dodecil sulfato de sodio. Use guantes protectores y protección para los ojos. Evite el contacto con la piel, los ojos y la ropa. No inhale vapores. Trabaje en un espacio bien ventilado, por ejemplo, una campana extractora.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
    3. Alternativamente, realice un paso de elución no desnaturalizante para obtener VLP con estructura de proteína nativa conservada.
    4. Añada 25 μL de tampón de elución (frecuentemente suministrado con las perlas) a las perlas magnéticas e incube durante 2-5 min a temperatura ambiente.
    5. Retire las perlas y transfiera el eluido a un tubo limpio. Utilice el eluido para ensayos posteriores o guárdelo a 4 °C.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

Resultados

Figura 1: Ilustración esquemática de los pasos clave del ensayo de captura VLP utilizando sobrenadantes libres de células. (1) El ensayo de captura VLP comienza con la unión de los bNAbs del VIH-1 a las perlas magnéticas acopladas a la proteína G. Mientras tanto, se prepara la solución VLP con una concentración definida de p55. El sobrenadante de cultivo libre de células consiste en ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de reacción de 1,5 mL	Eppendorf
10x PBS	gibco	70011044
Anticuerpos (bnAbs)	Polímun Scientic
Dynabeads Proteína G Kit de inmunoprecipitación	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	Incluye topes y lavado Soluciones
Celdas FreeStyle 293-F	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	R790-07
FreeStyle 293 Expresión Media	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Bastidor de separación magnética	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	S1509S	para tubos de 12 x 1,5 mL o 6 x 1,5 mL
Ultracentrífuga Optima XE-90	Beckman Coulter
Fluoruro de polivinilideno (PVDF) Filtros de jeringa, 0,45 μm	Carl Roth	KC89.1
de transferencia de PVDFDE membrana, 0,45 μm	Carl Roth	T830.1
QuickTiter VIH p24 ELISA	Biolabs Celulares	VPK-108-H
músculo rotatorio	Heidolph	REAX2
Rotor SW28	Beckman Coulter
Termomezclador	Cel Media	básico
Trehalosa dihidratada	Carl Roth	8897.2
Tubos de centrífuga ultra transparentes	Beckman Coulter	344058