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1. Nuevo diseño de la cámara (Figura 1)
- Abra una nueva placa analizadora de células de doble cámara. Deje a un lado la cámara superior con electrodos.
- Con una fresadora, corte 2 mm de los pocillos inferiores en forma de U de la placa del analizador de células.
- Fije una membrana de polietersulfona (PES) de 2 cm x 7 cm con un tamaño de poro de 0,2 μm en el fondo de los pocillos afeitados con adhesivo curado con UV. Espere 30 minutos de curación para asegurarse de que el pegamento esté completamente curado e inerte.
- Con una fresadora, corte dos ranuras longitudinales (1,5 mm x 5,6 mm) a lo largo de los lados para encajar en las crestas de la tercera cámara recién fabricada.
- Usando una fresadora, cree una tercera cámara de policarbonato que reproduzca las dimensiones totales de la placa del analizador de celdas: 72 mm x 18 mm (Tabla de materiales).
- Cree pocillos de 4,8 mm de profundidad y 4,75 mm de diámetro para replicar el diseño de 16 pocillos de la placa del analizador de células. Esto permite 90 μL de volumen por pocillo.
- En los lados, cree dos crestas triangulares para que la cámara encaje en las ranuras originales creadas en el paso 1.4. La parte horizontal del triángulo es de 1,5 mm, la vertical es de 1,4 mm y la hipotenusa es de 2,052 mm.
- Cree una perilla en el lado corto de 50,8 mm de diámetro y 1,397 mm de altura para que encaje en la muesca de la placa original (Figura 1, Medio).
- Utilice una arandela de goma de 0,9 mm de grosor para cada pocillo para proporcionar un ajuste sellado.
2. Cultivo celular (MDA-MB-231, CDIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblastos)
- Lave los cultivos celulares adherentes (~70% de confluencia) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x.
- Agregue una solución de tripsina-EDTA al 0,05% para levantar las células.
- Neutralizar la solución de tripsina con medios de cultivo celular que contengan suero y contar las células utilizando una alícuota de la suspensión celular.
nota: Los medios específicos de cultivo celular se pueden encontrar en la Tabla 1.
3. Disociación de xenoinjertos derivada del paciente
- Picar un trozo de tumor fresco (1 cm2) en papilla fina con un bisturí estéril.
- Colocar en un tubo cónico de 50 mL con 20 mL de medio DMEM F12 suplementado con 3 mg/mL de tripsina y 2 mg/mL de colagenasa.
- Incubar en un agitador térmico (150 RPM) a 37°C durante 20 min.
- Girar el tubo a 500 x g durante 5 min; retira el sobrenadante.
- Añadir 20 μL de DMEM F12 + 2% FBS para lavar las células; centrifugar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Repite el lavado dos veces más.
- Vuelva a suspender en 1 mL de medio PDX (Tabla 1) para contar las células.
4. Extracción de células de médula ósea
- Enjuague el filtro de recolección de médula ósea (BM) con 25 mL de 1x PBS.
nota: En este estudio, se añadió PBS a un filtro de recolección de MO usado del hospital para recolectar la MO restante en el filtro.
- Agregue el BM enjuagado lentamente a un tubo cónico de 50 mL con 25 mL de medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de mantener las capas lo más separadas posible.
- Centrifugar a 800 x g durante 20 min a 18 °C.
- Sifón de las capas superiores después de la centrifugación (grasa/plasma) y transfiera 5 mL de la capa blanca por encima del medio de gradiente de densidad que tiene las células BM a un tubo cónico de 15 mL.
nota: Como alternativa, sumerja una pipeta de 5 ml en la capa superior hasta que toque la capa intermedia (BM) y pipetee la capa intermedia muy lentamente sin mover la pipeta.
- Llene el tubo cónico de 15 mL con 1x PBS (~10 mL) y gire a 300 x g durante 15 min.
- Retire el sobrenadante; la bolita blanca restante es el BM.
- Si se observan glóbulos rojos en el gránulo, agregue 5 mL de solución de lisis de glóbulos rojos (Tabla de materiales) y déjela reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Girar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
- Añadir 10 mL de 1x PBS para lavar las células, centrifugar a 300 x g durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Repita la lisis de glóbulos rojos (paso 4.7) hasta que el pellet esté blanco.
5. Siembra y ensamblaje de células
- Coloque las tres cámaras estériles en la campana de cultivo de tejidos.
- Ubique la perilla en el lado corto de la cámara inferior. Oriente la cámara inferior de modo que la perilla quede orientada hacia el experimentador.
- Agregue de 30.000 a 50.000 células en 90 μL de medio a cada pocillo de la cámara inferior. Evite formar burbujas. Estas son las células estromales que proporcionarán factores secretados, pero no serán detectadas por los electrodos de la cámara superior.
- Utilice medios suplementados con suplementado con suero fetal bovino al 5% en dos pocillos de la cámara inferior como control positivo de la motilidad celular. Utilice medios suplementados con 0% de suero como control negativo.
- Deje reposar la cámara inferior con las celdas durante 10-15 minutos en la campana para que se asiente.
nota: Este paso se recomienda si las células son adherentes o crecen en suspensión.
- Gire la cámara inferior a 90° y coloque la cámara central en la parte superior de modo que la perilla de la cámara inferior se deslice en la muesca de la cámara central.
nota: La perilla en la cámara inferior y el punto azul en la cámara central están en extremos opuestos del conjunto.
- Empuje verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un clic en cada uno de los lados largos del ensamblaje.
- Añada 160 μL de medio sin suero a todos los pocillos de la cámara central.
- Asegúrese de que un menisco en forma de cúpula sea visible después de llenar los pocillos; de lo contrario, ajuste el volumen final en función de la calibración de la pipeta. Evite formar burbujas.
- Coloque la cámara superior con los electrodos hacia abajo en la cámara central, asegurándose de alinear los puntos azules en las cámaras central y superior.
- Empuje verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un clic en cada uno de los lados largos del ensamblaje.
- Añada 25-50 μL de medios sin suero a la cámara superior.
- Monte el conjunto en el analizador celular de doble propósito en la incubadora de cultivo de tejidos y espere 30 minutos antes de medir el fondo.
nota: Este tiempo es necesario para equilibrar la matriz y se puede utilizar para preparar las líneas celulares que se agregarán a la cámara superior.
- Mida el fondo (consulte la sección 6) y vuelva a colocar el conjunto en la cubierta de cultivo de tejidos.
- Agregue 30.000-50.000 células en 100 μL de medio sin suero a cada pocillo de la cámara superior. Estas son las células que el electrodo detectará una vez que migren con éxito a través de la membrana
nota: Para lograr la máxima respuesta, se recomienda cultivar células en medios sin suero o con bajo contenido sérico durante 6-18 h antes de realizar el ensayo.
- Deje reposar el conjunto en el capó durante 30 minutos antes de montarlo en el analizador de celdas de doble propósito para la medición de impedancia.
6. Medición de fondo e impedancia
- Coloque la matriz en la base del instrumento analizador de células de doble propósito.
- Abra el software del analizador de células y seleccione la base que se va a utilizar.
- Haga clic en la pestaña Mensaje y asegúrese de que diga Conexiones OK para asegurarse de que la matriz esté bien colocada en la base y que los electrodos estén bien alineados con los sensores.
- Haga clic en la pestaña Notas del experimento y complete la mayor cantidad de información posible sobre el experimento.
- Haga clic en la pestaña Diseño y rellene la descripción del diseño de la matriz.
- Haga clic en la pestaña Programar y agregue dos pasos desde el menú Pasos; un paso de fondo (un barrido) y un paso de prueba con 100 barridos, un barrido cada 15 minutos, con un total de 25 h.
- Después de que el conjunto haya estado en la incubadora analizadora de células de doble propósito durante 30 minutos, haga clic en el botón Reproducir para iniciar la medición en segundo plano. Aparecerá una ventana que te pedirá que elijas la carpeta para guardar los datos.
- Una vez realizada la medición de fondo, retire la matriz de la base y vuelva a colocarla en la cubierta de cultivo celular.
- Agregue células a la cámara superior como se describe en el paso 5.13 y mantenga el conjunto en la campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos para que las células se asienten.
- Vuelva a colocar la matriz en el analizador de celdas de doble propósito y compruebe la pestaña Mensaje para ver el mensaje Conexiones correctas.
- Haga clic en el botón Reproducir para iniciar la medición de impedancia.
- Haga clic en la pestaña Trazar para monitorear el progreso de la señal.
- Si se alcanza el punto final antes de 25 h, haga clic en el paso Anular del menú desplegable Ejecutar.
- Para exportar datos, haga clic con el botón derecho en el gráfico, elija Copiar en formato de lista y luego pegue los datos en una hoja de cálculo.
nota: Los datos se pueden exportar como índice de celda o índice de celda delta. La información de gráfico y/o diseño también se puede elegir para la exportación.
Tabla 1: Composición de los medios de cultivo celular. En la tabla se enumeran las composiciones de los medios MDA-MD-231, los medios de fibroblastos J2, los medios DCIS y los medios PDX.
| Medio | Componentes | Concentración/proporción |
| Medios MDA-MD-231 | DMEM | |
| Suero fetal bovino (FBS) | 10% |
| Medios de fibroblastos J2 | DMEM | |
| Suero fetal bovino (FBS) | 10% |
| Medios DCIS | DMEM F12 | |
| Suero de caballo (HS) | 5% |
| Factor de crecimiento epidérmico (EGF) | 20 ng/mL |
| insulina | 10 μg/mL |
| hidrocortisona | 0,5 μg/mL |
| Toxina del cólera | 100 ng/mL |
| Medios PDX | DMEM F12 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | 2% |
| HEPES | 1 M |
| Transferencia de insulina elalenio etanolamina (ITS) | 10 μg/mL |
| hidrocortisona | 0,5 μg/mL |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | 1 mg/mL |
