Ensayo de Actividad de Citrato Sintasa: Un ensayo colorimétrico para medir la actividad mitocondrial de la citrato sintasa en el homogeneizado de tejidos de Drosophila

Resumen

Fuente: Wei, P., et al., Un ensayo colorimétrico de la actividad de la citrato sintasa en Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe un ensayo colorimétrico para medir la actividad de la citrato sintasa mitocondrial presente en el homogeneizado tisular de Drosophila.

Protocolo

1. Ensayo colorimétrico de actividad de citrato sintasa para D. melanogaster

1. Recolecta diez moscas adultas por cada muestra. Recoja al menos muestras triplicadas para cada genotipo.
2. Prepare 500 μL de tampón de extracción helado que contenga 20 mM de HEPES (pH = 7,2), 1 mM de EDTA y 0,1% de tritón X-100 en un tubo de ensayo de 1,5 mL para cada muestra.
3. Anestesiar moscas adultas con CO₂ en una almohadilla de anestesia y aislar los tejidos deseados. Para aislar los tórax de las moscas adultas, por ejemplo, fije los tórax de las moscas con un par de pinzas y luego aísle el abdomen de las moscas cortando a lo largo del borde del tórax y el abdomen con unas tijeras. Recoja los tórax de la mosca para el ensayo de actividad de la citrato sintasa muscular.
   nota: Determine el peso fresco del tejido en este paso si lo usa para normalizar la actividad de la citrato sintasa.
4. Transfiera 10 tórax de mosca adulta a 100 μL de tampón de extracción helado inmediatamente y homogeneice con un mortero en hielo. Para mantener las muestras heladas, homogeneice las muestras durante 5-10 s en hielo, luego haga que las muestras se asienten en hielo durante 5 s y repita hasta que todos los tejidos del tubo estén completamente homogeneizado>nota: Tape el tubo, verifique los homogeneizados para asegurarse de que no haya coágulos en los homogeneizados y que los tejidos del tubo estén homogeneizados por completo. Todos los tratamientos de muestra deben realizarse con hielo.
5. Tome 10 μL de cada muestra homogeneizada en un tubo nuevo para medir el contenido de proteínas. Mantenga las muestras para la medición de proteínas en hielo.
   nota: Las muestras de proteínas pueden congelarse y almacenarse a -80 °C para su posterior análisis. Las concentraciones de proteínas sirven como parámetro interno para la normalización de las actividades de la citrato sintasa.
6. Agregue 400 μL de tampón de extracción helado a cada muestra restante para obtener un volumen total de 500 μL. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces, evitando la formación de burbujas. Para cada reacción, añadir 1 μL de lisado celular diluido a 150 μL de la solución de reacción recién preparada (20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM de DTNB, 0,3 mM de acetil CoA, 1 mM de ácido oxaloacético). Mezclar bien e inmediatamente pipeteando suavemente, evitando la formación de burbujas. Mida la absorbancia a 412 nm cada 10-30 s durante 4 min a 25 °C utilizando un lector de placas capaz de medir la absorbancia a 412 nm a intervalos mínimos de 10 s.
   nota: Cambie la punta antes de pipetear un reactivo diferente y evite formar burbujas en los pocillos. La mezcla incompleta de los reactivos puede causar variaciones en las mediciones. El ensayo de actividad de la citrato sintasa debe realizarse a temperatura ambiente inmediatamente después de recoger las muestras, ya que este ensayo se utiliza para cuantificar la masa mitocondrial intacta. El tampón de reacción debe prepararse inmediatamente antes de su uso y no debe almacenarse.
7. Represente los datos como densidad óptica (OD), absorbancia (abs) (eje Y) frente al tiempo (en minutos) (eje X). A continuación, calcule la pendiente de la parte lineal de la curva, donde la velocidad de reacción es
   
   Divida el valor por la concentración de proteína de la muestra para normalizar la actividad de la citrato sintasa. La actividad de la citrato sintasa se calcula como
   
   nota: La concentración de proteína de la muestra se puede medir mediante un kit de ensayo de concentración de proteína.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanosulfónico (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Base TRIZMA)	Sigma-Aldrich	V900483
Acetil-CoA	Sigma-Aldrich	A2181
Ácido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB)	Sigma-Aldrich	D8130
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
oxaloacetato	Sigma-Aldrich	O4126
Mortero de pellets	Sangón	F619072
Motor de mortero de pellets	Tiangen	OSE-Y10
Lector de placas	BioTek	eón
Kit de ensayo de proteínas BCA	Beyotime	P0010S
tijeras	WPI (en inglés	Año 14124
Tritón X-100	Sangón	A110694-0100

)