Ensayo de protección enzimática basado en lisostafina: un método in vitro para cuantificar la carga intracelular de Staphylococcus aureus mediante la muerte selectiva mediada por enzimas de bacterias extracelulares

Resumen

Fuente: Rigaill, J. et al. Ensayo de protección enzimática mejorado para estudiar la internalización de Staphylococcus aureus y la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, demostramos un ensayo de protección enzimática in vitro basado en lisostafina para cuantificar la internalización de Staphylococcus aureus en células A549. El ensayo ayuda en estudios cualitativos, cuantitativos y de caracterización de la carga bacteriana intracelular en las células huésped.

Protocolo

1. Inoculación celular

1. Comience con un cultivo de células epiteliales humanas A549 en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa con rojo fenol, suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) sin antibióticos.
2. Observe cada pocillo de la placa de 24 pocillos mediante microscopía de bajo aumento para asegurarse de que las células epiteliales humanas estén sanas y crezcan como se espera.
3. Retire y deseche el medio de cultivo celular gastado de la placa de 24 pocillos.
4. Añadir 500 μL de la suspensión bacteriana de Staphylococcus aureus preparada en DMEM sin rojo fenol, para su inoculación a cada pocillo con células 100% confluentes.
5. Incubar las células durante 2 h a 36 ± 1 °C y 5% de CO₂.
   NOTA: se recomienda utilizar tres pocillos de la placa para cada condición a probar (triplicado) y realizar al menos tres experimentos independientes. El retraso de la incubación se puede adaptar de acuerdo con el objetivo experimental.

2. Cuantificación de bacterias intracelulares con ensayo de protección enzimática mejorada (iEPA)

1. Prepare 7 mL de tampón de lisis 4x con 3,5 mL de Triton X-100 al 2% en agua estéril y 3,5 mL de tripsina-EDTA.
2. Prepare una solución madre de lisostafina a 10 mg/ml en tampón de acetato y una alícuota de 25 μL en crioviales. Almacenar a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
3. Prepare 250 μL de una solución de trabajo de lisostafina fresca a 1 mg/mL mezclando 25 μL de la solución madre de lisostafina (10 mg/mL) y 225 μL de Tris-HCl 0,1 M. Almacenar a 4 °C durante un máximo de 48 h.
4. Prepare 6,25 mL de medio de infección completa suplementado con lisostafina añadiendo 6 mL de medio de infección completa a 250 μL de la solución de trabajo de lisostafina.
5. Añada 250 μL de medio infeccioso completo suplementado con lisostafina en cada pocillo y agite suavemente la placa girándola con la mano.
6. Incubar las células durante 1 h a 36 ± 1 °C en 5% de CO₂ para que la lisostafina mate las bacterias extracelulares.
7. Al final del tiempo de incubación, agregue 10 μL de proteinasa K a 20 mg/mL en cada pocillo para inactivar la listapfina.
8. Incubar las celdas durante 2 minutos a temperatura ambiente.
9. Añadir 250 μL de tampón de lisis 4x para lisar las células por choque osmótico.
10. Incubar las células durante 10 min a 36 ± 1 °C.
11. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo diez veces por todo el fondo del pocillo para asegurarse de que las células estén completamente lisadas y homogeneizadas.
12. Utilice un plato de espiral automático para determinar la carga de S. aureus de cada pozo.
13. Incubar las placas de agar durante 18-24 h a 36 ± 1 °C.
14. Al día siguiente, cuente el número de colonias con un contador de colonias para calcular la carga intracelular de S. aureus de cada pocillo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 24 pocillos	HALCÓN DE CORNING	353047
Línea celular A549	ATCC	CCL-185
Solución tampón de acetato pH 4,6	Fluka	31048	Se utiliza para preparar una solución madre de lysostpahine a 10 mg/mL en acetato de sodio de 20 mM.
AMBICINA (lisostapafino recombinante)	AMBI	LSPN-50	Lisostapafino recominante liofilizado. Congelar a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
COS - Agar Colombia + 5% de sangre de oveja	Biomerieux	43049	En su lugar, se puede utilizar cualquier placa de agar adecuada para el cultivo de estafilococos.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, alta glucosa con rojo fenol	Sigma-Aldrich	D6429
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, alto contenido de glucosa sin rojo fenol	Sigma-Aldrich	D1145
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con MgCl2 y CaCl2, filtrada estérilmente	Sigma-Aldrich	D8662
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, filtrada estérilmente	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral diluido	Interscience	414000	Diluyente automático y plato en espiral
Suero fetal bovino	Gibco	10270-106
Proteinasa K, recombinante 20 mg/mL	Eurobio	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, lote 901727
Escaneo 4000	Interscience	438000	Contador automático de colonias
Agua estéril	Otec	600500
TC20 Contador de células automatizado	Biorad	1450102	Contador automático de células
Tris 1 M pH 8.0	Invitrogen	AM9855G	Se utiliza para preparar la solución de trabajo de lisostafina a 1 mg/mL en Tris-HCl 0,1 M.
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tripsina - Solución de EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	0,05% de tripsina porcina y 0,02% de EDTA en la solución salina equilibrada de Hanks con rojo fenol
Microscopio de fluorescencia de campo amplio	Nikon	Ti2