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>Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE
1. Preparación de la solución
NOTA: Manipule y prepare todos los reactivos y soluciones con cristalería sin hierro o plástico desechable. No permita que los materiales metálicos de laboratorio (por ejemplo, espátulas de acero inoxidable) entren en contacto con ningún reactivo o solución, debido al riesgo de contaminación por hierro. Asegúrese de que cualquier cristalería reutilizable no tenga plancha. Lave los materiales con detergente de laboratorio adecuado durante 30-60 min, enjuague con agua desionizada, remoje durante la noche en una solución de ácido nítrico al 37% diluida 1:3 con agua desionizada, enjuague nuevamente con agua desionizada y deje secar.
- Mezcla de ácidos: Añadir 10 g de ácido tricloroacético a 82,2 mL de ácido clorhídrico al 37% en una botella de vidrio, disolver completamente y ajustar el volumen final a 100 mL con agua desionizada. Agitar antes de usar. Alternativamente, use solo ácido clorhídrico al 37% para la digestión de tejidos.
nota: La solución es estable durante al menos 2 meses cuando se almacena en frascos de reactivos de vidrio marrón oscuro.
cautela: El ácido clorhídrico y el ácido tricloroacético son corrosivos, y las formas concentradas liberan vapores ácidos tóxicos. Use prendas protectoras, guantes resistentes a productos químicos y gafas protectoras contra salpicaduras de productos químicos en todo momento cuando manipule ácidos. Evite inhalarlos y siempre manipule los ácidos mientras esté debajo de una campana extractora.
- Acetato de sodio saturado: Añadir 228 g de acetato de sodio anhidro a 400 mL de agua desionizada en una botella de vidrio y agitar durante la noche a temperatura ambiente. Deje reposar la solución y precipitar durante un día. Si no hay precipitaciones, continúe agregando pequeñas cantidades de acetato de sodio. Guarde la solución en una botella de vidrio.
- Reactivo de cromógeno: Para preparar 1 mL de reactivo de cromógeno, agregue 1 mg de sal disódica de ácido disululónico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL de agua desionizada y 10 μL de ácido tioglicólico concentrado (100%) y disuelva completamente. Compensar el volumen final a 1 mL con agua desionizada.
nota: Prepare la cantidad de reactivo de cromógeno que sea necesario. La solución es estable durante 1 mes cuando se protege de la luz.
- Reactivo de cromógeno de trabajo (WCR): Agregue 1 volumen del reactivo de cromógeno a 5 volúmenes de acetato de sodio saturado y 5 volúmenes de agua desionizada.
nota: Esta solución debe prepararse fresca el día de su uso.
- Solución estándar de hierro en stock: Para preparar una solución de hierro en stock de 20 mM, coloque 111,5 mg de polvo de hierro carbonílico en un matraz aforado de 250 mL que contenga 5.480 μL de ácido clorhídrico al 37%. Dejar disolver toda la noche a temperatura ambiente (o incubar en un baño de agua hirviendo). Luego, prepare la solución hasta un volumen final de 100 mL con agua desionizada.
nota: La solución estándar se puede conservar indefinidamente cuando se almacena en un recipiente herméticamente sellado.
- Solución estándar de hierro de trabajo (WISS): Agregue 13,5 μL de ácido clorhídrico al 37% a 500 μL de agua desionizada. Agregue 10 μL de la Solución Estándar de Hierro Madre y compense el volumen final a 1 mL con agua desionizada (11.169 μg de Fe/mL, 200 μM; medido por AAS).
nota: La solución de trabajo debe prepararse frescamente el día de su uso.
2. Secado de muestras
- Cortar una muestra de tejido de 10 a 100 mg con una hoja de bisturí. Péselo con precisión en una balanza analítica/de precisión sobre una pequeña pieza de parafilm (Fresh Weight).
- Con unas pinzas de plástico, coloque el trozo de tejido en una placa de 24 pocillos (sin tapa para permitir la evaporación del agua) y déjelo secar en una incubadora estándar a 65 °C durante 48 h.
- Alternativamente, use un horno de digestión de microondas de laboratorio para secar muestras de tejido. Con unas pinzas de plástico, coloque el trozo de pañuelo pesado en un vaso de teflón sin hierro y séquelo en el microondas. Ajuste los parámetros de funcionamiento de acuerdo con el manual de instrucciones del instrumento.
nota: Como referencia, en la Tabla 1 se muestran los parámetros de funcionamiento para el secado de muestras de hígado utilizando el horno de digestión específico (ver Tabla de Materiales).
- Con pinzas de plástico, coloque cada pieza de tejido seco sobre una pequeña pieza de parafilm dentro de una balanza analítica/de precisión y pésela con precisión (peso seco).
3. Muestra de digestión ácida
- Con pinzas de plástico, transfiera cada trozo de tejido seco a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Agregue 1 mL de la mezcla de ácido y cierre el tubo de la microcentrífuga. Prepare un blanco de ácido de la misma manera, excepto que se omite el tejido.
cautela: La mezcla ácida es corrosiva y libera vapores tóxicos. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas protectoras contra salpicaduras de productos químicos cuando manipule la mezcla de ácido. Evite inhalarlo y manéjelo siempre mientras esté debajo de una campana extractora.
- Digiera los tejidos incubando los tubos de microcentrífuga en una incubadora a 65 °C durante 20 h.
- Después de enfriar a temperatura ambiente, transfiera 500 μL del extracto ácido claro (amarillo) (sobrenadante) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL utilizando una micropipeta provista de puntas de plástico. Si no es posible obtener un sobrenadante claro, realice un centrifugado corto.
cautela: El sobrenadante es muy ácido. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas protectoras contra salpicaduras de productos químicos cuando manipule los sobrenadantes. Manipule siempre bajo una campana extractora.
nota: En este punto, los extractos ácidos se pueden utilizar inmediatamente para el ensayo colorimétrico o congelar a -20 °C para su uso posterior. Descongele completamente las muestras congeladas a temperatura ambiente y vértelalas antes de usarlas.
4. Desarrollo del color
- Prepare las reacciones de cromógeno como se indica en la Tabla 2 en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml o, para un mayor rendimiento, directamente en las microplacas de poliestireno transparentes sin tratar de fondo plano, de 96 pocillos. Prepare todas las reacciones (ácido, blanco, patrón y muestra) al menos por duplicado.
- Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
5. Lectura de absorbancia
- Mida la absorbancia de la muestra en un espectrofotómetro o lector de placas a una longitud de onda de 535 nm frente a una referencia de agua desionizada. Las placas se pueden leer sin tapa o con tapa. En el caso de la tapa, elimine cualquier condensación formada debido a la liberación de vapores ácidos de la tapa justo antes de la medición para evitar posibles interferencias con la lectura de absorbancia.
nota: La absorbancia óptica del blanco ácido leído contra el agua desionizada (referencia) debe ser inferior a 0,015; La absorbancia óptica del patrón y de las muestras debe estar entre 0,100 y 1,000. Para muestras con un contenido de hierro muy alto o muy bajo, puede ser necesario ajustar los volúmenes de extracto ácido (sobrenadante) y diH2O (Tabla 2): si la absorbancia es superior a 1,0, utilice un volumen de muestra (sobrenadante) más pequeño; Cuando la absorbancia sea inferior a 0,1, utilice un volumen mayor del sobrenadante. El volumen de la muestra (Vsmp) se tiene en cuenta al calcular el contenido de hierro en los tejidos de cada muestra (véase el paso 6).
6. Cálculo del contenido de hierro en los tejidos
- Calcule el contenido de hierro en los tejidos no hemo con la siguiente ecuación:
Hierro tisular (μg/g de tejido seco) = Ecuación 1
AT = absorbancia de la muestra de ensayo
AB = absorbancia del ácido en blanco
AS = absorbancia del patrón
Fes = concentración de hierro de WISS (μg Fe/mL)
W = peso del tejido seco (g)
Vsmp = volumen de la muestra (volumen variable de sobrenadante en la Tabla 2 convertido a mL)
Vf = volumen final de la mezcla ácida después de la incubación nocturna a 65 °C (correspondiente al volumen de ácido más el volumen de tejido seco en mL; si los pesos de las muestras no difieren significativamente, suponga un volumen constante ≈ 1 mL)
Vstd = volumen estándar de hierro (volumen de WISS en la Tabla 2 convertido a mL)
Vrv = volumen final de reacción (volumen total en la Tabla 2 convertido a mL)
Tabla 1: Parámetros de funcionamiento para el secado del hígado en un horno de digestión por microondas utilizado aquí
| Potencia 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Presión (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tiempo (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tiempo a presión (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| abanicar: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabla 2: Preparación de reacciones de cromógeno en tubos de 1,5 mL o placas de 96 pocillos.
| | WCR (μL) | Mezcla ácida (μL) | Sobrenadante (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Volumen total (μL) |
| 1.5 mL tubos | Blanco ácido | 1000 | 150 | | | 150 | Año 1300 |
| estándar | 1000 | 150 | | 150 | | Año 1300 |
| muestra | 1000 | | variable | | variable | Año 1300 |
| 96 pocillos | Blanco ácido | 150 | 22.5 | | | 22.5 | Artículo 195 |
| estándar | 150 | 22.5 | | 22.5 | | Artículo 195 |
| muestra | 150 | | variable | | variable | Artículo 195 |