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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Expansión de los progenitores de OC
- Vuelva a suspender las PBMC en α-MEM completo (10 % de FBS, 1 % de pluma/estreptococo, 1 % de anfotericina B) que contengan 20 ng/ml de m-CSF. Siembre PBMC a una densidad de 2,5 x 105 células/cm2. Por lo general, las células aisladas de 15-20 mL de sangre fresca se pueden sembrar en un matraz de 75cm2 (1,5-2 x 107 células).
- Alimente las células con α-MEM completo fresco que contenga 20 ng/mL M-CSF cada tercer día hasta que las células adjuntas alcancen la confluencia deseada. Los rendimientos típicos son de 1,5-2 x106 células/matraz cuando las células tienen un 95% de confluente. Por lo general, el período de expansión dura 6 días.
nota: El potencial osteoclastogénico de los precursores puede disminuir con un tiempo de cultivo prolongado.
2. Inducción de osteoclastogénesis en placas recubiertas de fosfato de calcio
- Para facilitar la adhesión celular, incubar las placas recubiertas de fosfato de calcio (CaP) con 50 μL de FBS durante 1 h en una incubadora a 37 °C.
- Para separar los precursores de OC, lave el matraz con PBS dos veces para eliminar las células muertas o no adherentes. Añadir 4 mL de tripsina (Tabla de Materiales) pormatraz de 75 cm2, durante 30 min.
- Agregue 4 mL de α-MEM completo para detener la digestión, separe cuidadosamente las células con un raspador de células y transfiera las células a un tubo de 50 mL.
- Determine el número total de células utilizando una cámara de Neubauer o similar.
- Granule las células por centrifugación durante 7 min a 350 x g. Vuelva a suspender el pellet en un α-MEM completo suficiente que contenga 20 ng/mL M-CSF y 20 ng/mL RANKL para obtener una concentración de 1 x 106 células/mL.
- Aspire la solución FBS de la placa de 96 pocillos recubierta de CaP y pipetee: 200 μL de suspensión de celdas por pocillo (2 x 10,5 celdas/pocillo).
- Incubar los precursores de OC durante el período de tiempo deseado o con los reactivos deseados relevantes para el diseño experimental. Por lo general, se puede observar un alto número de CO grandes y multinucleados después de 6 días y cuando se están formando pozos de reabsorción. Alimente las células con medio α-MEM completo fresco que contenga 20 ng/mL M-CSF y 20 ng/mL de RANKL cada tres días.
- Al final de la incubación, lavar las células con PBS dos veces, fijarlas con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y volver a lavar con PBS.
- Utilice los OC fijos directamente para la tinción de fluorescencia o almacene a 4 °C.
3. Tinción de fluorescencia de OCs y recubrimiento de fosfato de calcio
- Incubar las células fijas con tampón de permeabilización (0,1% Triton en PBS) durante 5 min.
- Teñir los filamentos de actina con 100 μL de solución de faloidina marcada con AlexaFluor 546 en PBS durante 30 min y aspirar la solución de tinción. Añada 100 μl de solución de tinción Hoechst 33342 (10 μg/ml en PBS) durante 10 min para teñir los núcleos. También se puede utilizar DAPI.
- Teñir el recubrimiento de CaP con 100 μL de 10 μM de calceína en PBS durante 10 min. Lavar tres veces con PBS y tomar imágenes.