Ensayo de fosa de resorción: una técnica in vitro para cuantificar la actividad de resorción de calcio de osteoclastos maduros utilizando placas de cultivo recubiertas de fosfato de calcio

Resumen

Fuente: Cen, W., et al. Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro. J. Vis. Exp. (2022)

En este video, describimos un ensayo de reabsorción osteoclástica in vitro en placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio cultivadas con osteoclastos derivados de células mononucleares de sangre periférica humana. Los osteoclastos forman un anillo de actina característico en la matriz recubierta de fosfato de calcio de la placa de cultivo celular y degradan la matriz dentro de la región del anillo de actina para liberar iones de calcio y fosfato, lo que resulta en la formación de distintos pozos de reabsorción dentro de la matriz degradada.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Expansión de los progenitores de OC

1. Vuelva a suspender las PBMC en α-MEM completo (10 % de FBS, 1 % de pluma/estreptococo, 1 % de anfotericina B) que contengan 20 ng/ml de m-CSF. Siembre PBMC a una densidad de 2,5 x 10⁵ células/cm². Por lo general, las células aisladas de 15-20 mL de sangre fresca se pueden sembrar en un matraz de 75^cm2 (1,5-2 x 10

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
α-MEM	Gibco	32561-029	MEM alfa, GlutaMAX, sin nucleósidos
anfotericina B	Biochrom	03-028-1B	Solución de anfotericina B
Calceína	Sigma-Aldrich	C0875	Calceína
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	suero fetal bovino
Tampón de fijación	Bioleyenda	420801	Paraformaldehido
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	M-CSF humano recombinante
Pbs	Lonza	17-512F	Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X), DBPS sin calcio y magnesio
Estreptococo en pluma	Lonza	DE17-602E	Mezcla de penicilina y estreptomicina
Faloidina-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Faloidina
RANKL	PeproTech	310-01	Ligando sRANK humano recombinante (derivado de E. coli)
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alquilfenil polietilenglicol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Enzimas recombinantes de disociación celular