Ensayo de oxidación de sustrato en células cultivadas: un ensayo in vitro para cuantificar la oxidación del sustrato en células mediante la medición de señales radiactivas de CO2 atrapado

Resumen

Fuente: Song, C. et al., Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with ¹⁴CO₂ Trapping. J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra una técnica de cuantificación para el CO₂ liberado durante la oxidación del sustrato utilizando ¹⁴sustratos radiomarcados con C. El ¹⁴_CO2 liberado queda atrapado en una solución alcalina y se cuantifica mediante un contador de centelleo. La oxidación de diferentes sustratos varía entre tejidos y refleja la condición fisiopatológica del tejido.

Protocolo

El uso de materiales radiactivos (RAM) requiere la aprobación previa de un comité de seguridad designado en cada institución.

1. Preparación de soluciones madre para ¹⁴sustratos marcados con C

1. Prepare 4 mM de solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) mezclando 11 g de BSA y 33,1 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y agitándola suavemente a temperatura ambiente durante ~ 3 h hasta que BSA se disuelva por completo. Calentar la solución madre BSA en un baño de agua a 70 °C antes de usar.
2. Secar al aire 50 μCi ¹⁴C-oleato (50 μCi/μmol en etanol) en el vial con la tapa quitada durante 8 h en una campana de trabajo RAM designada. Agregue 312,5 μL de_H2O y luego 3,5 mg (11,5 μmol) de oleato de sodio. Homogeneizar.
3. Calentar la solución resultante a 70 °C en un baño de agua. Agregue 0,9375 mL de la solución madre BSA precalentada para producir 10 mM de solución madre de oleato caliente (que contiene una proporción de 1:11,5 de ¹⁴C-oleato a oleato sin marcar). Alicuente la solución madre y guárdela a -20 °C para su uso a largo plazo.
4. Use ¹⁴C-glucosa y ¹⁴C-glutamina directamente después de descongelar.

2. Preparación de un medio que contiene ¹⁴sustratos marcados con C

>NOTA: Para garantizar concentraciones fiables de sustratos energéticos en los medios, se deben utilizar medios hechos a medida con sustratos nuevos añadidos poco antes de su uso. En este caso, se utiliza un Medio Esencial Mínimo (MEMα) hecho a medida sin glucosa, piruvato, glutamina, rojo de fenol o bicarbonato de sodio. Sin embargo, se debe determinar un medio óptimo para cada tipo de célula.

1. Reconstituir 8,67 g del polvo medio en 1 L de agua purificada. Añadir 2,2 g de bicarbonato de sodio para conseguir un pH de 7,4 y filtrar la solución mediante filtración al vacío de 0,22 μm.
2. Agregue ingredientes frescos para obtener el medio completo (cMEMα) con concentraciones finales de 5,5 mM de glucosa, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato y 10% de suero fetal bovino (FBS). Además, complemente cMEMα con 100 mM de L-carnitina y 10 μM de HEPES para facilitar la oxidación de los ácidos grasos.
3. Inmediatamente antes de usar, agregue ¹⁴sustratos marcados con C a cMEMα recién preparado para hacer medios calientes. Para hacer el oleato en medio caliente, agregue la solución madre de oleato caliente de 10 mM a cMEMα para una concentración final de 100 μM de oleato (dilución 1:100, radiactividad final 0,4 μCi/mL).
   nota: El stock de oleato caliente de 10 mM que contiene una proporción de 1:11,5 de oleato caliente: frío (véase el paso 1.3) se utiliza para alcanzar un nivel fisiológico de 100 μM de oleato total en el medio, minimizando al mismo tiempo la cantidad de material radiactivo.
4. Prepare 10 mM de caldo de oleato sin etiquetar añadiendo 24,36 mg de oleato de sodio a 2 mL de_H2Oen un baño de agua a 70 °C durante ~20 min hasta que se disuelva por completo antes de mezclar rápidamente con 6 mL de la solución madre de BSA de 4 mM precalentada a 70 °C. Transfiera a un baño de agua a 37 °C durante 1 h y filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Alícuota y almacenar a -20 °C para uso a largo plazo.
5. Para calentar la glucosa en un medio, añadir ¹⁴C-glucosa hasta una concentración final de 1,333 μM (dilución 1:4.125, radiactividad final 0,4 μCi/mL). Para hacer glutamina en medio caliente, agregue ¹⁴C-glutamina a la concentración final de 2 μM (dilución 1:1,000, radiactividad final 0.4 μCi/mL).
6. Suplementar el medio caliente de glucosa y glutamina con una solución madre de 10 mM de oleato sin marcar del paso 2.4 para lograr la concentración final de 100 μM de oleato, la misma que en el medio caliente de oleato.

3. Preparación de las células

NOTA: Los preosteoblastos del calvario y los macrófagos de la médula ósea se utilizan aquí como ejemplos. Los usuarios deben preparar el tipo de célula de su elección de acuerdo con los protocolos adecuados. Optimizar la concentración de colagenasa II que se utilizará para la digestión en experimentos piloto, ya que la actividad enzimática puede variar entre diferentes lotes.

1. Aislamiento y cultivo de preosteoblastos de la pantorrilla
   1. Sacrificar a las crías del día postnatal 3-5 (P3-5) por decapitación y transferirlas a DPBS helados que contengan penicilina-estreptomicina (P/S).
   2. Exponga la pantorrilla eliminando la piel y los tejidos blandos. Recoja la región media cortando los tejidos circundantes de atrás hacia adelante en DPBS (Figura 1A). Rasque suavemente las superficies internas y externas de la pantorrilla con pinzas para ayudar a liberar las células en la digestión posterior.
   3. Prepare una solución de 2 mg/mL y una solución de 4 mg/mL de colagenasa tipo II en DPBS y filtre cada solución con un filtro nuevo de 0,22 μm. Digiera primero la calvaria limpia con la solución de colagenasa de 2 mg/ml durante 15 minutos y deseche la solución de digestión. Digiera las muestras limpias en 4 mg/mL de solución de colagenasa 3 veces durante 15 minutos cada vez, agrupando y guardando la solución de digestión.
   4. Filtre la solución de digestión a través de filtros de celdas de 70 μm y centrifugue el filtrado a 300 × g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet de celda en cMEMα (ver paso 2.2) que contenga 10% de FBS y P/S.
   5. Cuente y siembre las celdas en 4 × 10⁴ celdas/cm2 en placas de 10 cm. Cultivar las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante 3 días.
   6. Disociar las células a 37 °C con tripsina-EDTA al 0,25%. Cuente y siembre las células en placas de cultivo celular de 24 pocillos con cMEMα que contenga 10% de FBS y P/S a 7,5 × 10⁵/^cm2. Siembre al menos 4 pocillos por tipo de célula por sustrato y al menos tres pocillos adicionales para cada tipo de célula para el recuento de células antes del ensayo.
   7. Cultive las células a 37 °C durante la noche antes de los ensayos de oxidación del sustrato.
2. Aislamiento y cultura de BMMs
   NOTA: El cultivo de BMMs requiere el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), que puede adquirirse comercialmente como proteína recombinante. El medio acondicionado de la línea celular CMG14-12 diseñado para expresar M-CSF es una alternativa económica utilizada aquí.
   1. Recoja fémures y tibias de ratones de 8 semanas de edad después de extirpar el músculo y los tejidos conectivos. Corta y desecha ambos extremos de los huesos con unas tijeras afiladas.
   2. Enjuague la médula ósea de un fémur y una tibia en una placa de Petri de 10 cm con una jeringa provista de una aguja de 23 G que contenga 15 mL de cMEMα con un 10% de FBS, P/S y un 10% de CMG14-12 medio acondicionado (medio BMM). Cultive las células en la placa de Petri en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
   3. Después de 3 días, deseche el medio de cultivo y enjuague con DPBS. Disociar las células adheridas a 37 °C con tripsina-EDTA al 0,25% durante 5 min. Centrifugar y resuspender el pellet de la célula en el medio BMM.
   4. Contar y sembrar las células en placas de cultivo celular de 24 pocillos a 7,5 × 10⁵/^cm2 de la misma manera que se describe en el punto 3.1.6. Cultivo a 37 °C durante la noche en el medio BMM antes de comenzar los ensayos.

4. Ensayo de oxidación del sustrato con trampa de CO₂

NOTA: Se debe determinar una densidad de siembra adecuada para cada tipo de célula para lograr una confluencia del 80-90% antes del inicio del ensayo. Tenga en cuenta que la densidad celular puede afectar el estado metabólico de las células.

1. Lave las celdas en los pocillos adicionales dos veces con DPBS. Disociar las células con tripsina-EDTA al 0,25% y mezclar 20 μL de células resuspendidas en DPBS con 20 μL de solución de colorante comercial lista para usar de naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI). Determine el número de células vivas con un contador de células automatizado y registre el número para los cálculos finales.
2. Lave las células en los pocillos de ensayo dos veces con DPBS. Agregue 500 μl de medio caliente a cada pocillo de ensayo en la campana de cultivo de tejidos designada por RAM. Selle las placas con parafilm e incube las células en una incubadora designada por RAM a 37 °C durante 4 h.
3. Durante la incubación, corte el papel de filtro en trozos circulares ligeramente más grandes que el área dentro de la tapa de los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e inserte el papel cómodamente en la tapa (Figura 1B). Añadir 200 μL de ácido perclórico 1 M a cada tubo y 20 μL de hidróxido de sodio al papel de filtro colocado en el interior del tapón.
4. Después de la incubación de las células, transfiera 400 μL de medio de cultivo de cada pocillo a los tubos preparados y cierre las tapas inmediatamente. Deje los tubos en una rejilla de tubos a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Durante la incubación, coloque un vial de centelleo para cada tubo y llénelo con 4 ml de líquido de centelleo. Transfiera cada trozo de papel de filtro a un vial de centelleo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
6. Realice pruebas de limpieza en la campana de cultivo de tejidos, el baño de agua (utilizado para la preparación de ¹⁴C-oleato), el refrigerador, la incubadora, el fregadero, el suelo y cualquier otra área de trabajo para detectar una posible contaminación de RAM. Coloque las toallitas de papel en viales de centelleo que contengan líquido de centelleo.
7. Mida la radiactividad ^{de 14}C en los viales de centelleo con un contador de centelleo. Registre los resultados de la lectura. Descontamine el entorno de trabajo de acuerdo con las pautas de seguridad radiológica si es necesario.

Resultados

Figura 1: Diagramas para el ensayo de captura de CO₂ y la disección de la calvaria. (A) La región media de la calvaria, indicada por el triángulo discontinuo naranja, se recolecta para el aislamiento de celdas. (B) Los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL se utilizan para la captura de_CO2 (paso 1). Los papeles de filtro (papel azul con fines ilust...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtros de 0,22 μm	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Se utiliza para filtrar la solución BSA
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200056	Disociar células del cultivo celular Placas
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	PR1MA	PR MCT17 RB	Se utiliza para la incubación de reacciones
Platos de 10 cm	TPP	93100	Se utiliza para el cultivo celular
Jeringa de 10 mL	Bd	302995	Se utiliza para lavar la médula de huesos
10% FBS	Productos biológicos de Atlanta	S11550	Para la preparación del medio de cultivo celular
14C -Glucosa	PerkinElmer	NEC042X050UC	Se utiliza para hacer medios calientes
14 C-glutamina	PerkinElmer	NEC451050UC	Se utiliza para hacer medios calientes
14 C-oleato	PerkinElmer	NEC317050UC	Se utiliza para hacer medios calientes
Aguja de 23 G	Bd	305120	Se utiliza para lavar la médula de huesos
Placas de 24 pocillos	TPP	92024	Se utiliza para el cultivo celular
Filtros de células de 70 μm	MIDSCI	70CELDA	Se utiliza para filtrar el sobrenadante durante Digestión Cavarial
Naranja de acridina/Yoduro de propidio Tinte (AO/PI)	Nexcelom Biociencias	CS2-0106	Tiñe las células vivas para determinar la semilla densidad
Suero bovino Ablumin	Proliant Biológicos	68700	Se utiliza para la conjugación de ácidos grasos
Celómetro Auto 2000	Nexcelom Biociencias		Determinar el número de células viables
centrífuga	Termo Fisher	Leyenda Micro 21R	Se utiliza para pellets de células
Colagenasa tipo II	Worthington	LS004176	Disociar las células del tejido
Alfa de MEM personalizado	GIBCO	Referencia: ME 18459P1	Se utiliza para crear medios calientes personalizados
tamponado con fosfato de Dulbecco Salino	Gibco	10010023	Se utiliza para disolver y diluir reactivos, y lavar los platos de cultivo
Papel de filtro	Millipore-Sigma	WHA1001090	Atrapa el CO2 con hidróxido de sodio
glucosa	Sigma-Aldrich	G7528	Se utiliza para crear medios personalizados
HEPES	Gibco	15630080	Atrapa el CO2 durante el cultivo celular
L-carnitina	Sigma-Aldrich	C0283	Complementado para la oxidación de ácidos grasos
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	Se utiliza para crear medios personalizados
MEM alfa	termo	A10490	Medio de cultivo celular
Parafilm	Envases de plástico Pecheney	PM998	Se utiliza para sellar placas de cultivo celular
Penicilina-Estreptomicina	Termo Fisher	15140122	Evita la contaminación en el cultivo celular
Ácido perclórico	Sigma-Aldrich	244252	Libera CO2 durante la Ensayo
piruvato	Sigma-Aldrich	Página 5280	Se utiliza para crear medios personalizados
Contador de centelleo	Beckman Coulter	LS6500	Determina la radiactividad a partir del Papel de filtro
Fluido de centelleo	MP Biomedicals	882453	Absorber la energía emitida por las RAM y lo vuelven a emitir como destellos de luz
Vial de centelleo	Fisher Científico	03-337-1	Recipientes de reacción para centelleo fluido
sosa	Sigma-Aldrich	S5761	Tampón de equilibrio para medio
hidróxido sódico	Sigma-Aldrich	58045	Atrapa el CO2 durante el ensayo de metaboilc
Oleato de sodio	Santa Cruz	SC-215879	Ácido graso conjugado BSA preparación
Filtración al vacío 1000	TPP	99950	Filtro cMEMα