Ensayo de separación de fases de proteínas: un método optogenético para la separación de fases de proteínas de unión a ARN mutante en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

En este artículo

Resumen

Fuente: Asakawa, K. et al. Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2022)

En este video, describimos un ensayo de separación de fases, en el que las proteínas intracelulares que comprenden regiones intrínsecamente desordenadas fusionadas a un dominio de oligomerización fotosensible son inducidas a través de la exposición a la luz azul para autoasociarse en condensados similares a líquidos sin membrana.

Protocolo

>Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE

1. Preparación del LED para la iluminación con luz azul

Encienda un panel LED utilizando la aplicación asociada instalada en una tableta/teléfono. Coloque la sonda de un espectrómetro en un pozo vacío de un plato de 6 pocillos y ajuste la luz LED a la longitud de onda que alcanza un máximo de ~ 456 nm a través de la aplicación. Coloque el sensor óptico de un medidor de potencia óptica en el pozo vacío y ajuste la potencia de la luz LED (~0....

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Resultados

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Figura 1: Comparaciones radiométricas de opTDP-43h y EGFP-TDP-43z antes y después de la estimulación lumínica. (A) Los ROI que cubren los somas de cuatro células mnr2b positivas a 48 y 72 hpf se extrajeron en función de la señal EGFP-TDP-43z y se muestran en magenta. Los ROI rectangulares (bg) se utilizaron para restar la señal de fondo (ROI de fondo). Las cifras son una adaptación d.......