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>Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE
1. Preparación del LED para la iluminación con luz azul
- Encienda un panel LED utilizando la aplicación asociada instalada en una tableta/teléfono. Coloque la sonda de un espectrómetro en un pozo vacío de un plato de 6 pocillos y ajuste la luz LED a la longitud de onda que alcanza un máximo de ~ 456 nm a través de la aplicación. Coloque el sensor óptico de un medidor de potencia óptica en el pozo vacío y ajuste la potencia de la luz LED (~0,61 mW/cm2). La configuración de la luz LED se puede guardar y se puede recuperar en la aplicación.
- Introduzca el ajuste del plato/panel LED en la incubadora a 28 °C. Finalice este paso antes de que comience la obtención de imágenes de los peces a 48 hpf.
2. Imágenes de larvas de pez cebra que expresan TDP-43 optogenético
- Seleccione los peces transgénicos dobles Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] al menos antes de 47 hpf, basándose en la fluorescencia RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) en la columna motora espinal utilizando el microscopio de epifluorescencia equipado con una lente de objetivo Plan-Neofluar 5x/0.15.
- Decorionar el Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peces doblemente transgénicos.
- Precalentar al 1% de agarosa a baja temperatura de fusión que contiene 250 μg/mL de sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato a 42 °C.
- Anestesiar brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peces doblemente transgénicos a 48 hpf en tampón E3 que contiene la misma concentración de Tricane.
- Ponga una gota de agarosa precalentada al 1% a baja temperatura de fusión en el plato base de vidrio a temperatura ambiente. El diámetro de la gota de agarosa en forma de cúpula en el plato de vidrio es de 8-10 mm.
- Con una pipeta Pasteur, agregue el pescado anestesiado a la agarosa a baja temperatura de fusión en el plato con base de vidrio y luego mezcle pipeteando varias veces. Minimice la cantidad de tampón E3 agregada a la agarosa junto con los peces.
- Mantenga al pez de costado usando una aguja de jeringa durante la solidificación de la agarosa (generalmente ~ 1 min) para asegurarse de que la médula espinal esté en una posición horizontal adecuada. Después de la solidificación, coloque un par de gotas de tampón E3 en el pez montado en agarosa en forma de cúpula.
- Adquiera secciones Z confocales en serie de la médula espinal escaneando con un microscopio confocal equipado con una lente objetivo de inmersión en agua de 20x con una apertura numérica de 1,00, utilizando una velocidad de escaneo de 4,0 μs por píxel (12 bits por píxel), un tamaño de paso de 1,0 μm por corte para el objetivo y una combinación de longitudes de onda de excitación/emisión: Canal 1) 473/510 nm para EGFP y canal 2) 559/583 nm para mRFP1.
nota: La cloaca en el lado ventral del pez se incluye en las regiones de interés (ROI) como referencia, lo que ayuda a identificar y comparar los segmentos de la columna vertebral (niveles 16-17) a través de los puntos de tiempo.
- Retire el pescado de la agarosa rompiéndola cuidadosamente con una aguja de jeringa tan pronto como se completen las imágenes. Mantenga la cantidad de tiempo que el pez está incrustado en la agarosa lo más corto posible, aunque la incrustación de la agarosa durante <30 minutos no afecta la viabilidad del pez.
3. Estimulación lumínica de peces que expresan opTDP-43h mediante la iluminación de campo de una luz de diodo emisor de luz azul (LED)
- Agregue 7.5 mL de tampón E3 al pozo y coloque el pez doble transgénico Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] en el pocillo. Coloque el plato de seis pocillos en el panel LED manteniendo el plato y el panel LED a 5 mm de distancia con un espaciador (por ejemplo, con cinco vasos deslizantes apilados).
- Encienda la luz LED azul. Mantenga algunos de los peces transgénicos dobles Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] en un plato separado de seis pocillos cubierto con papel de aluminio cuando sea necesario un pez de control no iluminado (es decir, en condiciones de oscuridad).
- Después de la iluminación (por ejemplo, durante 24 h a 72 hpf en la Figura 1), visualice la médula espinal del pez iluminado repitiendo los pasos 2.3 - 2.9.
