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>Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE
1. Cribado in vitro de moléculas pequeñas
- Prepare las placas de ensayo siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Vierta agua destilada esterilizada en autoclave en un canal estéril y, con una pipeta multicanal, dispense 40 μL de agua destilada del canal en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos.
- Prepare la herramienta de fijación y agregue los productos químicos.
- Coloque bandejas de clavijas (consulte la Tabla de materiales) cerca de la llama de un mechero Bunsen en una mesa de laboratorio. Agregue lo siguiente a las bandejas de clavijas sucesivas: 25 mL de solución de limpieza de alfileres, 35 mL de DMSO al 50% (en agua), 45 mL de agua destilada, 55 mL de EtOH al 70% y 65 mL de EtOH al 95%. Coloque un pedazo de papel secante frente a cada bandeja.
- Limpie la herramienta de fijación sumergiendo las clavijas en la solución de limpieza y moviendo las clavijas hacia arriba y hacia abajo tres veces (3 veces) en la solución. En este protocolo, '3x' y '10x' se definen como mover el pinner hacia arriba y hacia abajo en una solución tres o diez veces, respectivamente. Seca los alfileres en el papel secante. Repita este procedimiento una vez más.
- A continuación, enjuague los alfileres 3 veces en agua destilada, seguido de secar los alfileres. Repita el procedimiento una vez más.
- Por último, enjuague los alfileres 3 veces con EtOH al 95%, seguido de secar los alfileres. Repita una vez más. Enciende el pinner y deja que el etanol se evapore.
- Agregue productos químicos de las placas de stock químico de 96 pocillos a las placas de ensayo fijando 3x en la placa química y, a continuación, transfiriendo los pines 10X a la placa de ensayo. Seca sobre el papel frente a la solución de limpieza.
- Limpie la herramienta de fijación entre placas lavándola en el siguiente orden, secando en el medio en papel secante: 3 veces en 50% DMSO (una vez), 3 veces en agua destilada (una vez), 3 veces en 75% EtOH (una vez), 3 veces en 95% EtOH (dos veces). Flamea el pinner y deja que el etanol se evapore.
- Repita el paso 1.2.2 cuando se haya completado todo el anclaje.
nota: El cribado se realizó a una concentración final de 60 μM.
- Adición de gusanos
- Cuente el número de nematodos de la colección resuspendiendo primero y luego pipeteando 5 μL con puntas de baja retención en un portaobjetos para su observación. Cuente el número de nematodos en 5 μL usando un microscopio de disección.
- Ajuste la concentración a 2 gusanos/μL utilizando agua destilada estéril. Con una pipeta multicanal y un comedero, agregue 10 μL (~20 gusanos) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos.
nota: Se colectarán aproximadamente 15.000 nematodos D. dipsaci por placa de cultivo utilizando el método de cultivo y recolección descrito. Se utilizan veinte gusanos por pozo porque el pequeño número facilita la visualización clara y la contabilidad de los móviles e inmóviles.
- Selle las placas en una película de envoltura de laboratorio y envuélvalas con una toalla de papel húmeda. Coloque en una caja y fíjelo en una almohadilla adhesiva en una incubadora agitadora a 20 ° C configurada a 200 rpm. Asegúrese de que los platos estén estabilizados en la caja agregando una toalla de papel húmeda adicional para garantizar un movimiento mínimo de los platos.
2. Recopilación y análisis de datos
- Observe las placas el día 5 bajo un microscopio de disección. Cuente el número de móviles y el número total de D. dipsaci en los controles de solventes DMSO y en los pozos tratados con medicamentos.
- Si los gusanos están relativamente inmóviles, agregue 2 μL de 1 M de NaOH a una concentración final de 40 mM al pocillo para estimular el movimiento><.
nota: Después de agregar NaOH, los gusanos se moverán instantáneamente y deberán visualizarse dentro de los 5 minutos. El número de gusanos móviles y el número total de gusanos se utilizarán para calcular la proporción de gusanos móviles. La longitud del ensayo puede cambiar en función del objetivo de la pantalla.
- Calcule la proporción de gusanos móviles. En las pantallas de D. dipsaci, los pocillos que produjeron gusanos móviles con 0% de forma reproducible se categorizan como impactos fuertes.
nota: Se evita la exposición prolongada de las placas en la platina de los microscopios de disección porque la fuente de luz puede calentar las placas e inducir efectos variables en el bioensayo.