Ensayo de mineralización in vitro: un método colorimétrico para cuantificar los depósitos de calcio osteoblásticos en el sustituto de injerto óseo mediante tinción y extracción de rojo de alizarina S

Resumen

Fuente: Kampleitner, C. et al. Perfil de compatibilidad biológica en biomateriales para la regeneración ósea. J. Vis. Exp. (2018)

En este vídeo, describimos un método para la detección de depósitos de calcio secretados por osteoblastos utilizando un colorante aniónico, Alizarin Red S. Primero se tiñen los osteoblastos cultivados y luego se recupera el colorante para la cuantificación colorimétrica de los depósitos de calcio o el grado de mineralización de los osteoblastos.

Protocolo

1. Ensayo de mineralización de osteoblastos

1. Preincubar discos de fosfato β-tricálcico (β-TCP) de 14 mm de diámetro en 1 mL de medio de crecimiento óseo (BGM) en una placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h antes de añadir los osteoblastos (OB). Utilice placas de cultivo de tejidos estándar para los controles y placas de cultivo en suspensión para las muestras de biomaterial para evitar la adhesión de las células al plástico.
2. Aspire el medio de preincubación y luego vuelva a suspender los OB primarios de ratón en BGM. Agregue 8,8 x 10⁴ OB/cm² en los discos de β-TCP preincubados en una placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos y, para el grupo de control, en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (1 mL/pocillo). Los OB se adherirán a la placa de cultivo de tejidos o a la muestra de biomaterial.
3. Reemplace el BGM con 1 mL de medio de mineralización osteogénico (MM) que contenga BGM, 50 μg/mL de ácido ascórbico y 5 mM de β-glicerofosfato 24 h después de la adición de los OB e incube durante 14 días a 37 °C y 5% de CO₂. Cambie el medio cada 2-3 días con 1 mL de MM recién preparado en cada pocillo.

2. Mineralización osteoblástica evaluada mediante tinción con Alizarina Roja S (ARS)

1. Aspire el medio de cultivo de los pocillos que contienen OB primarios 14 días después de la adición de MM y enjuague dos veces con 0,5 mL de 1x PBS en RT. Aspire el PBS y fije las células agregando 0,5 mL de la solución de formalina tamponada al 10% en RT durante 10 min.
2. Aspirar el formol tamponado al 10% con una pipeta de un solo uso y lavar dos veces con 0,5 ml de agua ultrapura.
3. A los OB fijos, añadir 0,25 mL de 40 mM de solución de tinción ARS (pH 4,2) disuelta en agua ultrapura e incubar la placa a RT durante 10 min en un agitador a 100 batidos/min.
4. Aspire la solución de tinción con una pipeta de un solo uso y enjuague con 1 ml de agua ultrapura. Repita este paso de 5 a 10 veces para eliminar las tinciones inespecíficas.
   nota: La solución de enjuague debe no tener color.
5. Aspirar el agua ultrapura y añadir 1 mL de PBS frío. Incubar la placa en RT durante 10 min en un agitador a 100 batidos/min.
6. Aspire el PBS, transfiera los discos β-TCP teñidos a un nuevo pozo y escanee las placas con un escáner plano para registrar la mineralización.
7. Añadir 0,25 mL de solución de cloruro de cetilpiridinio al 10% e incubar la placa en RT durante 15 min en un agitador a 100 batidos/min para extraer el colorante ARS.
8. Transfiera los sobrenadantes a un tubo de 1,5 mL y centrifugue a 17.000 x g durante 5 min en RT.
9. Agregue una solución de cloruro de cetilpiridinio al 10% a los extractos con una relación de dilución de 1:10 a 1:20 y agregue las muestras (300 μL) en una placa de 96 pocillos que incluya dos pocillos en blanco que contengan solo un 10% de cloruro de cetilpiridinio.
10. Prepare 7 patrones de referencia ARS que van de 4 a 400 μM diluyendo la solución de tinción de 40 mM de ARS (pH 4.2) con una solución de cloruro de cetilpiridinio al 10% para generar una curva estándar.
11. Añada 300 μL del patrón de referencia por duplicado a la placa de 96 pocillos.
12. Lea la absorbancia de las muestras, los blancos y los estándares de referencia a 520 nm.
13. Reste las lecturas en blanco de los estándares de referencia y las lecturas de muestra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Discos de fosfato tricálcico β (β-TCP, 14 mm)			Los discos se sinterizaron en un horno de mufla a una temperatura de 1150 °C. Las muestras se irradiaron con UV (15 min para cada lado) antes de su uso en cultivos celulares
Alizarina Rojo S	Sigma-Aldrich	A5533
Medio de crecimiento óseo (BGM)			α-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina/estreptomicina
Solución de formalina neutra tamponada al 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Cloruro de hexadecilpirinio (cetilpiridinio) monohidratado	Sigma-Aldrich	C9002
Ácido L-ascórbico, 2-fosfato, sesquimagnesio, sal, hidrato	Sigma-Aldrich	A8960
Medio alfa MEM (α-MEM)	Tecnologías de Gibco Life	11900-073
Medio de mineralización osteogénico (MM)			α-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 50 μg/mL de ácido ascórbico + 5 mM β-glicerofosfato
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
β-Glicerofosfato sódico sódico hidratado	Sigma-Aldrich	G5422
Agua ultrapura: Libre de pirógenos en agua de cultivo celular	VWR	L0970-500
Placa transparente de 96 pocillos	Greiner bio-one	655001
Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos	Greiner bio-one	662102
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos	Greiner bio-one	662160
Centrífuga: VWR Mega Star 600R	VWR
Incubadora de CO2: HeraCell 240	Termo Científico
Escáner de cama plana: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Lector de microplacas Infinite M200 Pro	Tecan
Tubo de microcentrífuga: Tubo Eppendorf con cierre seguro de 1,5 mL	VWR	21008-959
Incubadora agitadora GFL3032	GFL (en inglés)	3032
Pipeta de un solo uso: pipeta de suero	Greiner bio-one	612301