1. Preparación de perlas para la implantación de gel
- Tome un cultivo que contenga microperlas portadoras recubiertas con células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y pericitos.
- Examine las placas que contienen las perlas recubiertas de microportadores bajo el microscopio utilizando el objetivo 20X para asegurarse de que todas las perlas hayan sido suficientemente recubiertas por las células endoteliales.
- Pipetear enérgicamente la solución de células en placa para separarlas de la placa de 6 cm y colocar la solución en un tubo. Lave la placa 2 veces más con medios completos y transfiérala al tubo para recoger todas las perlas residuales que puedan adherirse a la placa.
- Evite introducir burbujas de aire y utilice una pipeta p1000 para minimizar el esfuerzo cortante en las perlas recubiertas de células endoteliales.
- Espere 3 minutos para permitir que las perlas de la solución se asienten en el fondo del tubo.
- Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el pellet de perlas con una punta de pipeta p1000 (no utilice un aspirador de vacío).
- Agregue 1 ml de medio completo a cada tubo y vuelva a suspender las perlas.
- Espere de 30 a 60 segundos para permitir que las cuentas se asienten en el fondo. A continuación, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta P1000 sin alterar el pellet de perla. No utilice un aspirador de vacío, ya que la probabilidad de extraer accidentalmente el pellet de perlas aumenta considerablemente.
- Repita los pasos 1.6 y 1.7 dos veces más. El objetivo es eliminar la mayor cantidad posible de HUVEC que flote libremente y que pueda haberse desprendido de la placa de 6 cm, sin eliminar demasiadas perlas recubiertas de HUVEC, que deberían depositarse en los tubos de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de fondo redondo más rápidamente que las células que flotan libremente.
- Agregue 1 mL de medio completo a las cuentas.
2. Incrustación de perlas recubiertas en un gel de fibrina
- Retire la mayor cantidad de medios posible sin alterar el gránulo de perlas en cada tubo FACS con una pipeta P1000.
- Vuelva a suspender las perlas en 2,5 mL de solución de fibrinógeno.
- Pipetee 13 μL de solución de trombina en cada pocillo deseado de una placa con fondo de vidrio de 24 pocillos. El enchapado en un plato con fondo de vidrio es esencial para permitir una imagen óptima de los brotes.
NOTA: No deje la trombina en un pozo durante más de 5-10 minutos antes del siguiente paso.
- Agregue 0.5 mL de solución de perla/fibrinógeno a cada pocillo.
- Asegúrese de volver a suspender la solución de perlas mucho antes de pipetear la solución cada vez.
- Tenga cuidado de pipetear cuidadosamente directamente en la trombina ya presente en el pocillo. Pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para mezclar bien la solución, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
- Asegúrese de cambiar la punta de la pipeta entre pocillos.
- Tenga cuidado de no mover ni alterar la placa en ningún momento durante la coagulación inicial de la fibrina, ya que cualquier movimiento puede interrumpir la formación del gel.
- Deje reposar la placa en la campana durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Transfiera con cuidado la placa a una incubadora a 37 °C durante 1,5-2 h adicionales para permitir que el gel se solidifique por completo
3. Recubrimiento de fibroblastos sobre el gel de fibrina
- Durante los últimos 30 minutos de solidificación del gel, separe los fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF) de la siguiente manera:
- Lave un matraz T175 de células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego agregue 5 mL de solución de desprendimiento de células e incube a 37 °C durante 10 min.
- Resuspender NHLF a una concentración de 20.000 células/mL en medios completos.
NOTA: Las células NHLF se pueden cultivar con Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina estreptomicina.
- Coloque 1 mL de la suspensión de células NHLF en el gel de cada pocillo y vuelva a colocarlo en la incubadora.
- Cambie el medio completo cada dos días durante la duración del ensayo.
