1. Ensayo de contacto larvario (dosis puntual única o ensayo de dosis-respuesta)
>NOTA: El ensayo se puede realizar con productos químicos que sean solubles en agua o dimetilsulfóxido (DMSO), siempre que la concentración final de DMSO en los pozos de prueba no supere el 1%. Los disolventes alternativos pueden ser una opción, pero es esencial confirmar primero que la concentración final no causa más del 10% de mortalidad a las 72 h después de la exposición. El ensayo puede realizarse como un ensayo de dosis de un solo punto o de dosis-respuesta. Si se realiza esto último, se recomienda probar un rango de concentraciones (mínimo de cinco), que abarquen el LC50 esperado.
- Etiquete los pocillos de una placa de tejido transparente de 24 pocillos.
- Prepare una solución madre de la química de prueba en un tubo de 1,5 ml.
- Pesar cada producto químico utilizando una balanza analítica y, en función de las características de solubilidad, volver a suspenderlo en ddH2O, DMSO estéril u otro disolvente orgánico adecuado de su elección.
nota: Los cálculos deben tener en cuenta la pureza de la química. Por ejemplo, para una química con una pureza del 99 %, disuelva 10,1 mg en 1.000 μL de acetona para obtener una solución al 1 %. Sellar con film de parafina y conservar a -20 °C.
- Determine la concentración final de la sustancia química de prueba que se evaluará y prepare diluciones en serie a partir de la solución madre en consecuencia, utilizando el disolvente adecuado.
nota: La concentración y el volumen de la química y el solvente se pueden calcular utilizando la fórmula C1 * V1 = C2 * V2 donde C1 = concentración de la muestra 1, C2 = concentración de la muestra 2, V1 = volumen de la muestra 1 y V2 = volumen de la muestra 2.
- Prepare una solución madre de 10 mM y diluciones en serie según sea necesario para obtener las concentraciones de prueba deseadas (Tabla 1B).
- Con una pipeta de transferencia de plástico de diámetro ancho, transfiera cinco larvas L3 al pocillo de una placa de prueba de cultivo de tejidos; Las larvas L3 se pueden reconocer por la longitud (~ 2,5 - 3,5 mm) y el ancho de la cápsula de la cabeza de ~ 0,025 mm. Retire suavemente el agua con una pipeta de 1 mL y reemplácela con el volumen deseado de ddH2O. Repita para obtener n = 4 réplicas técnicas por tratamiento (es decir, 20 larvas en total por tratamiento).
- Agregue el volumen apropiado de química de prueba a cada uno de los cuatro pocillos replicados en la placa de prueba de 24 pocillos y agite suavemente la placa para asegurar una mezcla uniforme de la química. Coloque la placa en una cámara de prueba o de crecimiento en condiciones constantes (por ejemplo, se recomiendan 25 °C y ~ 75-85% de HR, y un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad si es posible)
nota: Para la reproducibilidad entre experimentos, asegúrese de que los ensayos posteriores se realicen en las mismas condiciones ambientales.
- Registre el número de larvas muertas/que no responden en cada pozo a los 30 min, 1, 1.5, 2, 3, 24, 48 y 72 h después de la exposición (o puntos de tiempo alternativos) en la hoja de puntuación (Tabla 2). Golpee suavemente el costado del plato. Si no se observa ningún movimiento, toque suavemente la larva con un palillo estéril. Marque las larvas que no responden al golpecito/tacto como "muertas".
nota: Se pueden observar y registrar otros fenotipos morfológicos y conductuales.
- Corrija la mortalidad de control utilizando la fórmula de Abbott modificada si lo desea, de la siguiente manera:
Mortalidad (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
donde X = el porcentaje de mortalidad en la muestra tratada, e Y = el porcentaje de mortalidad en el control.
- Grafice los resultados como un histograma o una curva logarítmica utilizando el software de su elección, como Graph-pad Prism 6 o similar, y calcule los valores de concentración letal (LC) en relación con el control.
- Repita el ensayo utilizando un lote separado de mosquitos para obtener n = 3 o más réplicas biológicas.
Tabla 1. Ejemplos de cálculos para el ensayo de dosis de punto único (A) para larvas L3 de Aedes aegypti y (B) con dosis-respuesta.
| A. Ensayos de dosis de un solo punto con tres químicas |
| química | Concentración (400 uM) |
| Amitriptilina | 80 mM Stock: 2 mg de amitriptilina X 98% (pureza del polvo) X 0,001 g/1 mg X 1 mol /313,86 g X 1 L/0,08 mol X 106 μL/L = 78,06 μL de agua. |
| Diluciones en serie: Diluir el stock 1:2 con ddH2O y luego 1:4 para lograr 10 mM. Agregue 40 μL de caldo de 10 mM al pocillo que contiene 960 μL de ddH20 para lograr una concentración final de 400 μM/pocillo. Prepare diluciones en serie de 10 mM de material 1:2 para lograr stocks de 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM y 0,625 mM. |
| Cis-(z)-flupenthixol | 80 mM Stock: 2 mg de cis(z)flupenthixol X 98% (pureza del polvo) X 0,001 g/1 mg X 1 mol/507,44 g cis(z)flupenthixol X 1L/0,08 mol X 106 μL/L = 48,28 μL de agua. |
| Diluciones en serie: Como en el caso anterior. |
| Amitraz | 80 mM Stock: 2 mg de Amitraz X 0,001 g/1 mg X 1 mol/293,4 g de amitraz X 1 L/0,08 mol X 106 μL/1 L = 85,21 μL de DMSO (nota: Amitraz solo es soluble en DMSO). |
| Diluciones en serie: Como en el caso anterior. |
| B. Ensayo dosis-respuesta |
| Química | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 |
| 400 μM | 200 μM | 100 μM | 50 μM | 25 μM |
| p. ej., Amitriptilina, cis-(Z)-flupenthixol oramitraz | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL |
| Stock de 10 mM | Stock de 5 mM | Stock de 2,5 mM | Stock de 1,25 mM | Stock de 0,625 mM |
Tabla 2. Ejemplo de hoja de puntuación utilizada para registrar los datos del ensayo de dosis-respuesta de larvas de mosquitos. Control, solo agua o agua con 1% de DMSO u otro solvente solamente. Las dosis típicas utilizadas para probar productos químicos antagonistas de moléculas pequeñas, como la amitriptilina, son 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM y 400 μM.
| Ensayo de larvas L3 para mosquitos |
| Fecha de inicio: |
| Investigador: |
| Especie/Cepa: |
| Tipo de ensayo: Dosis/respuesta dosis de un solo punto |
- Mortalidad (Nº de mosquitos muertos)
| | |
| Tiempo (horas) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | control |
| 0.5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| número arábigo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
- Porcentaje de mortalidad
|
| Tiempo (horas) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | control |
| 0.5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| número arábigo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
