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>Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE
1. Cultivo de mosquitos adultos
NOTA: Las cepas de mosquitos susceptibles a insecticidas están disponibles en el Repositorio de Referencia de Investigación y Reactivos contra la Malaria. Las cepas recomendadas son las siguientes: cepa Aedes aegypti Liverpool (LVP), cepa Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) y cepa Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- Cultivo de larvas de mosquitos a partir de huevos en un ciclo de 12 h día/12 h noche a 28 °C y 75-85% de humedad relativa (HR) en bandejas de plástico de 25 cm x 40 cm (~ 400 larvas por bandeja) según lo descrito por Nuss. Alimente a las larvas con jerbo terrestre (A. aegypti y An. gambiae) o alimento para peces en escamas (C. quinquefasciatus). Para los ensayos de larvas, recoja las larvas en la etapa del tercer estadio larvario (L3).
- Cría mosquitos adultos a partir de pupas que han sido transferidas a vasos de plástico y colocadas dentro de jaulas de plástico de 20 L en un insectario en las condiciones descritas anteriormente. Mantenga a los mosquitos con una solución de azúcar al 20% como se describe en otra parte. Recoja los adultos a los 3-5 días después de la emergencia.
2. Ensayo tópico para adultos (dosis puntual única o ensayo de respuesta a la dosis)
>NOTA: El ensayo tópico para adultos se realiza utilizando acetona como disolvente. Los disolventes alternativos pueden ser una opción, pero es esencial confirmar primero que la concentración final no causa más del 10% de mortalidad a las 48 h después de la exposición. El ensayo se puede realizar como un ensayo de dosis de un solo punto o un ensayo de dosis-respuesta y se utiliza para determinar la dosis letal (LD). Si se realiza esto último, se recomienda probar un rango de concentraciones (mínimo de cinco), que abarquen la LD50 esperada.
- Determine el número de mosquitos hembra adultos necesarios para completar el ensayo.
nota: Un ensayo de dosis puntual con un solo producto químico requerirá un mínimo de 90 mosquitos (30 para el control positivo, 30 para el control negativo con acetona sola y 30 para el producto químico de prueba).
- Cultive mosquitos hembra adultos de 3 a 5 días de edad y páselos a una cubeta de plástico separada de 20 ml con un aspirador (Figura 1).
- Etiquete los vasos de papel de 9 onzas con el nombre y la concentración de la química de prueba. Reserve cuadrados de malla de 10 cm x 10 cm y bandas elásticas para cada taza (vea la Figura 2).
- Seleccione un insecticida existente como control positivo (por ejemplo, el piretroide sintético, bifentrina) y prepare una solución madre al 1% (10 μg/μL) en acetona.
NOTA: Los cálculos deben tener en cuenta la pureza de la química. Por ejemplo, para una química con una pureza del 99 %, disuelva 10,1 mg en 1.000 μL de acetona para obtener una solución al 1 %. Sellar con film de parafina y conservar a -20 °C.
- Utilizando el mismo procedimiento que el anterior, prepare una solución madre de la química de prueba.
nota: Muchos productos químicos de prueba son muy lábiles, y las soluciones deben prepararse preferiblemente frescas cada vez que se realiza el bioensayo.
- Prepare diluciones en serie de los productos químicos de control positivo y prueba a partir de soluciones madre como se muestra en la Figura 3 utilizando viales de vidrio de 20 ml previamente enjuagados con acetona.
- Purgue una jeringa de vidrio de 1 ml con acetona, llénela con acetona y asegúrela en el microaplicador ajustado para proporcionar un volumen de 0,25 μl.
- Trabajando en lotes de diez, retire los mosquitos hembra adultos de 3 a 5 días de edad de las jaulas con un aspirador y anestesiar durante un máximo de cinco minutos a 4 °C en un refrigerador o con hielo. A continuación, transfiera los mosquitos a una placa de Petri y colóquela en hielo durante un máximo de 10 minutos.
- Trabajando rápidamente, retire una sola hembra con pinzas finas y aplique 0,25 μL de solución de prueba en el tórax dorsal con el microaplicador de jeringa. Confirme la administración de productos químicos mediante la observación con un microscopio de disección para asegurarse de que cada mosquito reciba el volumen adecuado de productos químicos de prueba.
- Transfiera el mosquito a un vaso de papel etiquetado que descanse sobre hielo y repita nueve veces para obtener n = 10 mosquitos tratados. Selle los mosquitos en el recipiente con un cuadrado de malla asegurado con una banda elástica y transfiéralos a una tina de plástico o cámara de crecimiento en condiciones constantes de 28 °C y 75-85% de HR (es preferible en un ciclo de 12 h día/12 h noche).
- Repita el experimento anterior dos veces para obtener n = 3 réplicas técnicas (es decir, 30 mosquitos en total) por grupo de tratamiento o control.
- Repita los pasos 2.7 a 2.10 primero con la química de prueba y luego con el control positivo.
nota: Otro control útil que se debe incluir si hay suficientes mosquitos disponibles es un "blanco" de 30 mosquitos anestesiados que no reciben ni la química de prueba ni el solvente.
- Registre el número de mosquitos "muertos/que no responden" a los 30 minutos, 60 minutos, 2, 24 y 48 horas después de la exposición (o puntos de tiempo alternativos) utilizando la hoja de puntuación (Tabla 1). Marque a los mosquitos como "muertos/que no responden" si muestran falta de movimiento, definida como acostados de lado o boca arriba y con la incapacidad de volar.
- Si lo desea, corrija la mortalidad de control utilizando la fórmula de Abbott modificada de la siguiente manera:
Mortalidad (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
donde X = el porcentaje de mortalidad en la muestra tratada, e Y = el porcentaje de mortalidad en el control.
- Muestra los resultados como un histograma o una curva exponencial. Para un ensayo de dosis-respuesta, calcule el valor de LD50, LD 75 o LD90 para la química de prueba en relación con el control.
- Repita el ensayo al menos dos veces utilizando lotes separados de mosquitos para obtener n = 3 o más réplicas biológicas.
