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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Ensayo de Alimentación Sanguínea en Adultos (Dosis Puntual Única o Ensayo Dosis-Respuesta)
- Recoja aproximadamente 150 mosquitos hembra adultos de 4 a 5 días de edad y transfiéralos a una jaula separada. Repita para obtener 6 jaulas si realiza un ensayo de dosis-respuesta. Retire la fuente de azúcar 1-24 h antes del ensayo de alimentación.
- Prepare una solución madre de productos químicos como se ha descrito anteriormente, teniendo en cuenta la pureza de la química (una solución madre típica es de 80 mM en tampón de agua o sal), y posteriormente prepare diluciones en serie en agua/tampón según sea necesario.
- Añadir 40 μL de cada una de las diluciones a 960 μL de sangre de conejo desfibrinada para obtener la concentración de prueba deseada. Aplique una película de membrana a una unidad de alimentación y selle con un anillo de goma. Transfiera 1 ml de sangre a través de una pipeta y conecte la unidad de alimentación a una unidad de calentamiento.
- Frote suavemente la superficie de la membrana con una solución de ácido láctico al 10% recién hecha y coloque la unidad de alimentación en la jaula de los mosquitos adultos. Cubra la jaula con una tela oscura o una bolsa de basura negra y permita que los mosquitos se alimenten durante una hora.
- Repita los pasos 1.2 a 1.4 para el resto de las soluciones de prueba y el control negativo (solo sangre).
- Al finalizar la alimentación, coloque cubos a 4 °C en un refrigerador durante 5 minutos para anestesiar a los mosquitos. Retire los mosquitos machos y los mosquitos hembra no alimentados, y cuente y registre el número total de mosquitos alimentados y parcialmente alimentados mediante un examen del abdomen.
- Retener a los mosquitos hembra parcial y totalmente alimentados, con el objetivo de un mínimo de 50 mosquitos alimentados con sangre por dosis.
- Transfiera los cubos a una tina de plástico o a una cámara de crecimiento en condiciones constantes de 28 °C y 75 - 85% de humedad relativa (es preferible en un ciclo de 12 h de día/12 h de noche).
- Registre el número total de mosquitos muertos/que no responden a las 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 y 72 h (o puntos de tiempo alternativos según lo desee) utilizando la hoja de puntuación (Tabla 1).
- Al tercer día después de la alimentación con sangre, introduzca una huevera en la jaula y recoja los huevos durante un período de 72 horas. Cuente el número total de huevos producidos por tratamiento bajo un microscopio de disección.
- Calcular el porcentaje de mortalidad y fecundidad en función del número total de mosquitos alimentados para cada grupo de tratamiento y el control. Corregir la mortalidad de control utilizando la fórmula de Abbott modificada si se desea.
- Muestre los datos de toxicidad y fecundidad como un gráfico de histograma o una curva exponencial (si se realiza un ensayo de dosis-respuesta) utilizando el software de su elección. Si realiza un ensayo de dosis-respuesta, calcule el valor de LD50, LD75 o LD90 para la química de prueba en relación con el control.
- Repita el ensayo al menos dos veces utilizando lotes separados de mosquitos para obtener n = 3 o más réplicas biológicas.
Tabla 1. Ejemplo de hoja de puntuación utilizada para registrar los datos del ensayo de alimentación sanguínea en adultos.Las dosis típicas utilizadas para probar la química de antagonistas de moléculas pequeñas, como la amitriptilina, son 50 μM, 100 μM, 200 μM y 400 μM.
| Mosquito Adulto (3-5 días de edad) Ensayo tópico |
| Fecha de inicio: |
| Investigador: |
| Especie/Cepa: |
| Tipo de ensayo: Punto único dosis/dosis-respuesta |
| A. Mortalidad (Nº de mosquitos muertos) |
| Tiempo (horas) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | control |
| 0.5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| número arábigo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| B. Porcentaje de mortalidad |
| Tiempo (horas) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | control |
| 0.5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| número arábigo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |