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1. Producción de lentivirus
NOTA: La producción y manipulación de vectores lentivirales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para la investigación con ADN recombinante. Se utiliza el plásmido que codifica el SOD1 de tipo salvaje y el mutante A4V marcado con YFP mejorado (SOD1WT-YFP y SOD1A4V-YFP). Ambos productos de fusión génica se amplificaron utilizando el par de cebadores de PCR 5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′ y 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′ y se insertaron en el plásmido pTRIP-delta U3 CMV utilizando sitios de restricción XhoI y BsrGI. Evitar más de 20 pasajes y mantener las celdas con una confluencia inferior al 60% ayuda a garantizar una buena eficiencia de transfección.
- El día 1, divida las células HEK-293T al 30 - 40% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro (3 x 10⁶ células/placa) en 10 mL de medio de cultivo celular (DMEM de alta glucosa con 10% de FBS y 4 mM de L-glutamina) para la producción del virus.
- Mantenga la placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro en una incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO₂) durante la noche.
- El día 2, prepare una solución de transfección de ADN que contenga 10 μg de vectores lentivirales (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP o -SOD1A4V-YFP) junto con los plásmidos de empaquetamiento lentiviral (5 μg de pVSVg; 10 μg de pCMV-dR8.71) (Figura 1A). Añadir 125 μL de 1 M de CaCl₂ y ajustar el volumen a 500 μL con agua destilada. Añadir suavemente 500 μL de 0,05 M HEPES a la mezcla e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Reemplace el medio de células HEK-293T con 10 mL de medio de cultivo fresco precalentado sin antibióticos mezclado con 1 mL de solución de transfección de ADN e incube durante la noche a 37 °C, 5% de CO₂.
- El día 3, reemplace el sobrenadante celular con medio de cultivo fresco.
- El día 4, coseche el sobrenadante en un tubo de 15 ml y centrifugue durante 5 minutos a 500 x g para eliminar las células muertas y los residuos. Purifique aún más el sobrenadante pasándolo a través de un filtro de 0,45 μm con una jeringa grande de 60 mL. Dispensar inmediatamente en alícuotas de un solo uso (300 μL) y almacenar a -80 °C. Para mantener la máxima actividad del producto, evite un ciclo de congelación y descongelación.
2. Transducción lentiviral
- Divida la línea celular que se va a infectar al 60% de confluencia (células HEK-293 y SH-SY5Y; 5 células de 10⁵ por pocillo y U2OS; 1 x 10⁵ células por pocillo) en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos en 2 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10%.
- Mantenga la placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos en una incubadora a 37 °C con un 5 % de CO₂ durante la noche.
- Retire el lentivirus congelado del congelador a -80 °C y descongele una alícuota en hielo antes de cada uso; no vuelva a congelar.
- Mientras el virus se descongela, caliente el medio de cultivo celular que contiene el suero compatible con la línea celular de interés. Una vez que el virus esté completamente descongelado, prepare una variedad de diluciones (1:3, 1:10, 1:30 y 1:100) en DMEM en un tubo de microfuga nuevo de 1,5 mL.
- Aumente el volumen de los tubos a 1 ml con medios séricos reducidos.
- Añada 2 μL de Polybrene (en un stock de 4 μg/μL) a 1 mL de virus/medio. Mezclar bien pipeteando y añadir 1 mL de mezcla a las células. Incubar las células con el virus durante 24 h.
- Elimine los medios antivirus y reemplácelos con medios DMEM normales complementados con un 10% de FBS. Mantener las celdas a 37 °C, 5% CO₂.
- Controle el crecimiento de las células y cambie los medios de cultivo cada dos días. En la confluencia, expanda la placa de 6 pocillos en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro.
- Una vez que las células se hayan expandido lo suficiente, siembre 1,5 x 10⁴ células por pocillo en 50 μL de medio DMEM en placas de ensayo de 384 pocillos para comprobar el nivel de expresión de la proteína marcada con YFP mediante microscopía. Si la expresión de la célula proteica marcada con YFP muestra una relación señal-ruido ≥3, prepare el stock celular para la línea celular correspondiente.
3. Efecto dependiente del tiempo del inhibidor del proteasoma en la agregación de proteínas
NOTA: Realice la adquisición de imágenes utilizando un microscopio automatizado (ver Materiales).
- Dispense 0,25 μL de DMSO o inhibidor del proteasoma disuelto en DMSO al 100% (ALLN, 2 mM) en placas de fondo plano de 384 pocillos.
- Siembrar manualmente 1,5 x 104 células por pocillo en 50 μL de medio DMEM en la misma placa de ensayo. La concentración final del inhibidor del proteasoma (ALLN) debe ser de 10 μM.
- Configure la unidad de control ambiental del sistema de microscopio a 37 °C y 5% de CO₂. En la Figura 2 se muestra una captura de pantalla de la configuración experimental.
- Opere el microscopio en modo de fluorescencia de campo amplio, utilizando el software con los siguientes ajustes: objetivo LWD 20X, modo no confocal, 4 campos/pocillo, con un intervalo de captura de una hora. Al final de cada ejecución, las imágenes capturadas se cargan automáticamente en el servidor.
4. Imágenes de lapso de tiempo para la expresión de YFP en células vivas y análisis de imágenes (canal único)
NOTA: Los siguientes pasos describen la aplicación del software (por ejemplo, Columbus).
- Seleccione el algoritmo adecuado para segmentar los objetos primarios (citosol y agregados). Si es necesario, ajuste el umbral de fondo y los parámetros de contraste (Figura 3).
- Cuente las células utilizando "células de búsqueda" con un umbral individual de 0,1 para el canal de intensidad YFP. Determine los agregados utilizando un algoritmo de "búsqueda de puntos" con una intensidad relativa de puntos YFP >0,2 y un coeficiente de división de 1,0.
5. Efecto de la respuesta a la dosis de los inhibidores del proteasoma sobre la agregación de proteínas en células vivas teñidas para sus núcleos (dos canales)
NOTA: Realice la adquisición de imágenes utilizando un microscopio automatizado. Determine el rango de concentración de los inhibidores del proteasoma (ALLN, epoxomicina y MG132) en función del valor esperado de IC50 para garantizar un ajuste óptimo de la curva.
- Prepare diluciones en serie de compuestos en una placa de polipropileno de almacenamiento de 384 pocillos mediante la serie de dilución estándar 1:3. Asegúrese de mezclar bien las diluciones de compuestos para asegurarse de que las concentraciones de compuestos sean precisas.
- Dispensar 0,25 μL de inhibidores del proteasoma en placas de ensayo negras vacías de 384 pocillos de fondo plano. Utilizamos un manipulador de líquidos equipado con un cabezal capilar de 384 capaz de transferir volúmenes.
- Siembre 1,5 x 1010⁴ células por pocillo en 50 μL de medio DMEM en placas de ensayo. Incubar las placas de ensayo a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
- Añadir 10 μL de medio DMEM (precalentado a 37 °C) con solución de tinción (Hoechst 33342 a un stock de 10 mg/mL) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Inicie el software operativo del microscopio. En la Figura 4 se muestra una captura de pantalla de la configuración experimental. Seleccione la pestaña "Configuración" y seleccione el objetivo 20X y el tipo de placa correcto. Asegúrese de que el "collar" esté configurado en el valor correcto en el objetivo, lo que permite un enfoque adecuado con diferentes tipos de placas.
- Seleccione la pestaña "Microscopio" y defina la exposición 1 como YFP (láser 488) y la exposición 2 como Hoechst (láser 405). Active el filtro en ambas exposiciones y asigne la exposición 1 a la cámara 1 y la exposición 2 a la cámara 2. Ajuste los tiempos de exposición a ~800 ms para la exposición 1 y a ~40 ms para la exposición 2.
- Seleccione la exposición 1. Ajuste la altura de enfoque a 0 μm. Seleccione "Enfoque". Una vez enfocado, exponga la cámara 1. Ajusta la altura de enfoque para optimizar el plano de exposición y haz clic en "Tomar altura". Cambie los tiempos de exposición y la potencia del láser para obtener una intensidad máxima de píxeles de ~3.000. Guarde los parámetros de exposición. Repita para la exposición 2.
- Seleccione la pestaña "Definición de experimento". Cree un diseño y un subdiseño. Arrastre y suelte el diseño, la exposición, la imagen de referencia, el archivo de recorte sesgado y el subdiseño relevantes. Guarde el experimento.
- Seleccione la pestaña "Experimento automático" y adquiera imágenes. Al final de cada ejecución, las imágenes capturadas se cargan automáticamente en el servidor.
6. Análisis de imágenes de dos canales
- Seleccione el algoritmo de software para segmentar los objetos primarios (núcleos, citosol y agregados) (Figura 5).
- Seleccione el método que segmenta los núcleos con precisión mediante la inspección visual de los objetos segmentados. Los objetos teñidos de Hoechst en el canal 1 (Ch1) se utilizarán para determinar el número de células. La tinción de YFP del mutante SOD1-A4V en el canal 2 (Ch2) se utilizará para determinar la cantidad de agregados.
- Cuente las células utilizando el algoritmo de "búsqueda de núcleos" como regiones de tinción de Hoechst >20 μm², con un factor de división de 7,0, un umbral individual de 0,40 y un contraste >0,10.
- Cree la tabla de datos y determine EC50 para cada uno de los compuestos utilizando la ecuación de "Regresión no lineal" en el software de gráficos.
