Ensayo de formación de agregados de proteínas: un método para detectar y cuantificar la agregación de proteínas en células cultivadas tras la inducción por inhibidor del proteasoma

En este artículo

Resumen

Fuente: Lee, H. et al. Desarrollo de ensayos para la cuantificación de alto contenido de la formación de agregados de proteínas mutantes sod1 en células vivas. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, demostramos un ensayo de agregación de proteínas basado en células utilizando inhibidores del proteasoma, que bloquean la actividad del proteasoma, evitando que las proteínas mutantes mal plegadas, fusionadas a una etiqueta fluorescente, sufran una degradación proteasómica dependiente de ubiquitina, lo que lleva a su acumulación dentro del citoplasma celular. A continuación, los agregados de proteínas se visualizan y cuantifican mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

1. Producción de lentivirus

NOTA: La producción y manipulación de vectores lentivirales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para la investigación con ADN recombinante. Se utiliza el plásmido que codifica el SOD1 de tipo salvaje y el mutante A4V marcado con YFP mejorado (SOD1WT-YFP y SOD1A4V-YFP). Ambos productos de fusión génica se amplificaron utilizando el par de cebadores de PCR 5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′ y 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′ y se insertaron en el plásmido pTRIP-delta U3 CMV utilizando sitios de restricción XhoI y BsrGI. Evitar más ....

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Resultados

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Figura 1. Generación de líneas estables SOD1 WT y A4V. (A) Diagrama esquemático de vectores lentivirales y de empaquetamiento (plásmidos de empaquetamiento y envoltura) para la generación de lentivirus SOD1 A4V de tipo salvaje y mutante. (B) Imágenes confocales seleccionadas de tres células (HEK-293, U2OS y SH-SY5Y) transducidas con el lentivirus SOD1 (WT) de tipo salvaje y el mutant.......