>Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Ensayo de Actividad de Endotoxinas (EAA)
- Recolectar muestras de sangre del paciente en tubos estériles que contienen anticoagulante EDTA. Almacene las muestras de sangre a temperatura ambiente
- Prepare los tubos de ensayo EA para cada muestra de sangre del paciente que necesite analizar. Coloque los tubos en rejillas para tubos. A continuación, retire las tapas.
- Cada prueba de EA consta de 5 tipos diferentes de tubos; use cada uno para una parte diferente de la prueba (consulte los pasos siguientes).
- Utilice el tubo #1 (el tubo de "control") para medir la actividad basal del estallido oxidativo inespecífico de los neutrófilos del paciente en ausencia de un anticuerpo específico.
- Utilice el tubo #2 (el tubo de "muestra") para medir el estallido oxidativo en respuesta al complejo de lipopolisacárido (LPS)-anticuerpo.
- Utilice el tubo #3 (el tubo "Max") para medir el estallido oxidativo máximo de los neutrófilos del paciente en respuesta a un exceso de endotoxina.
- Utilice el tubo #4 (el tubo "LPS") como fuente de endotoxina exógena.
- Use el tubo #5 (tubo "Alícuota") para el almacenamiento de sangre.
NOTA: Se proporcionan duplicados de los tubos # 1, # 2 y # 3 para un total de 8 tubos que se utilizarán para cada muestra de sangre que se analiza (el frasco de reactivo EA y la prueba de control de calidad se pueden usar para todas las pruebas contenidas en una bolsa).
- Con una pipeta combinada, pipetee un volumen de 1 mL del reactivo EA del frasco en los tubos #1 (Tubo de control), #2 (Tubo de muestra) y #3 (Tubo máximo), cada uno por duplicado.
NOTA: Pipetee por el costado del tubo para evitar que la solución vuelva a salpicar.
- Mezcle la muestra de sangre del paciente invirtiendo suavemente el tubo de extracción de sangre 20 veces. A continuación, pipetee 0,5 ml de sangre del paciente en el tubo #4 (tubo máximo de LPS) y el tubo #5 (tubo alícuota). Tubo de vórtice #4 durante 10 s.
- Coloque las gradillas de tubos con todos los tubos de ensayo EA en el agitador de la incubadora. Cierre la tapa e incube durante 10 minutos a una temperatura de 37 °C.
- Abra la tapa y retire las rejillas de tubos del agitador de la incubadora. Tubo de vórtice #5 (tubo alícuota). Con una punta estéril, pipetee 40 μL de sangre en los tubos #1 y #2, por duplicado.
- Tubo de vórtice #4 (tubo LPS). Con la misma punta de pipeta, pipetee 40 μL de sangre del tubo #4 en el tubo #3 (tubo máximo), por duplicado.
- Agite los seis tubos de ensayo finales (# 1, # 2, # 3 y sus respectivos duplicados), luego colóquelos nuevamente en sus estantes><.
NOTA: Asegúrese de que todos los tubos estén en vórtice durante la misma cantidad de tiempo.
- Vuelva a colocar las rejillas de tubos en el agitador de incubación y cierre la tapa. Ajuste el agitador de incubación a 100 rpm, luego inicie el movimiento durante 14 minutos.
- Inserte la tarjeta con chip etiquetada con EA en el quimioluminómetro y presione inicio. Después de la incubación de 14 minutos, siga las instrucciones que se muestran en el quimioluminómetro para leer los tubos EA en el orden correcto.
- Agite suavemente cada tubo durante 10 s antes de colocarlo en el portamuestras del quimioluminómetro. Abra el cajón de muestras y coloque el tubo #1 en el portamuestras. A continuación, cierre el cajón de muestras y espere la lectura de la unidad de luz relativa (RLU).
- Repita el paso 1.12 para el tubo 2 y el tubo 3.
- Repita el paso 1.12 para los tubos duplicados 1, 2 y 3.
nota: Intente hacer vórtice en todos los tubos durante la misma cantidad de tiempo durante los pasos 1.12 a 1.14.
- Una vez que se hayan procesado todos los tubos, tenga en cuenta que los resultados del EA se calcularán e imprimirán automáticamente. Los niveles se expresan como unidades EA y representan la media de las determinaciones duplicadas de las mismas muestras.
- Repita los pasos 1.4 a 1.15 para cada muestra de sangre que deba analizarse.
- Una vez finalizado el ensayo, almacene los tubos de ensayo y los reactivos de EA restantes a una temperatura de 2 a 8 °C durante un máximo de 30 días.
