Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus turbidimétrico: una técnica para detectar y cuantificar la contaminación por endotoxinas en fármacos nanoformulados

Resumen

Fuente: Neun, B. W. et al., Detección de endotoxinas en nanoformulaciones mediante ensayos de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019)

Este video describe el formato turbidimétrico del ensayo de lisado de amebocitos Limulus, o LAL, para estimar la contaminación por endotoxinas en nanoformulaciones de doxorrubicina liposomal pegilada. La turbidez de la solución después de la reacción de la endotoxina con el reactivo LAL ayuda a estimar la endotoxina en la muestra.

Protocolo

1. Preparación de muestras de nanopartículas

1. Prepare la muestra de estudio en agua de grado LAL.
2. Si el pH de la muestra está fuera del rango 6-8, ajuste el pH utilizando hidróxido de sodio sin pirógenos o ácido clorhídrico.
3. Usando agua de grado LAL, prepare varias diluciones de la muestra de estudio. Asegúrese de que la dilución más alta no exceda la dilución máxima válida (MVD).

2. Preparación de reactivos comunes entre formatos LAL

1. Diluir el caldo concentrado de hidróxido de sodio utilizando agua reactiva LAL sin pirógenos para preparar una solución de trabajo a una concentración de 0,1 N.
2. Diluir el caldo concentrado de ácido clorhídrico con agua reactiva de LAL sin pirógenos y preparar una solución de trabajo a una concentración final de 0,1 N.
3. Preparación de la endotoxina estándar de control (CSE)
   1. Reconstituya el CSE de acuerdo con el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      nota: Consulte la Tabla de Materiales para obtener detalles sobre el número de catálogo y la aplicación de una formulación de CSE determinada en diferentes formatos de LAL.
4. Preparación del reactivo LAL
   1. Reconstituya el reactivo LAL de acuerdo con el certificado de análisis proporcionado por el fabricante.
      nota: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el número de catálogo y la aplicación de una formulación de reactivo de LAL determinada en diferentes formatos de LAL.

3. Ensayo de turbidez LAL

1. Preparación de los patrones de calibración
   1. Utilizando 900 μL de agua de grado LAL y 100 μL de CSE, prepare tantas diluciones intermedias como sea necesario para permitir la preparación de un patrón de calibración con un rango de concentración de 0,001 a 1 UE/mL.
   2. Primero etiquete los tubos y agregue 900 μL de agua de grado LAL en cada tubo. A continuación, añada 100 μL de solución 10 UE/ml para preparar el patrón de calibración con una concentración de 1UE/mL.
   3. Repita la dilución en serie de 10 veces como se describe anteriormente para preparar tres patrones de calibración más bajos. Verificar que se han preparado cuatro patrones de calibración que van de 0,001 a 1 UE/ml.
2. Elaboración de los controles de calidad
   1. Prepare un control de calidad de 0,05 UE/ml combinando 50 μl de la solución de CSE de 1 UE/ml con 950 μl de agua de grado LAL.
3. Preparación de controles de inhibición/mejora (IEC)
   1. Preparar IEC con una concentración de 0,05 UE/ml combinando 25 μl de la solución de CSE de 1 UE/ml y 475 μl del nanomaterial de ensayo en una dilución dada.
4. Procedimiento experimental
   1. Deje que el instrumento se caliente encendiéndolo con aproximadamente 30 minutos de anticipación. Configure la longitud de onda de detección a 660 nm, ya que es apropiada para el LAL de turbidez.
   2. Inicie sesión escribiendo el nombre de usuario y la contraseña.
   3. Abra el software (Tabla de materiales) haciendo clic en el icono correspondiente en la pantalla de una computadora.
   4. Seleccione Recopilar datos en la pantalla de inicio del software. Introduzca el ID de prueba y la información del grupo de datos en el espacio correspondiente de la pestaña General de la pantalla de inicio.
   5. Haga clic en la pestaña Hardware y elija el tipo de instrumento en un menú desplegable.
   6. Configure la longitud de onda de detección a 660 nm, ya que es apropiada para el LAL de turbidez eligiendo el método de turbidez LAL.
   7. Verifique que aparezca un número de serie, un ID del sistema y la información del puerto serie en la pantalla. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aceptar una vez más para confirmar.
   8. Introduzca el ID de la muestra en el mismo orden en que se analiza la muestra. Utilice los botones predeterminados para introducir el control negativo, la curva estándar y las muestras de prueba.
   9. Prepare tubos duplicados para cada muestra y agregue 200 μL (relación de prueba 4:1) o 100 μL (relación de prueba 1:1) de control negativo (agua), estándares de calibración, control de calidad, IEC y nanopartículas de prueba en tubos de vidrio preetiquetados.
   10. Agregue 50 μL (relación de prueba 4:1) o 100 μL (relación de prueba 1:1) de reactivo LAL al primer vial de prueba, vístelo brevemente e insértelo en la ranura de prueba en el carrusel de instrumentos. Si se utiliza la proporción 1:1, el volumen del reactivo LAL es de 100 μL.
   11. Repita el procedimiento descrito anteriormente para otras muestras. Procese las muestras de una en una.
        

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
hidróxido sódico	sigma	S2770	Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6 y 8
ácido clorhídrico	sigma	H9892	Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6 y 8
Reactivo LAL	Asociados de Cape Cod	T0051	Este reactivo solo se puede utilizar con el ensayo de turbidez
Estándar de control de endotoxinas	Asociados de Cape Cod	E0005	Este reactivo se puede utilizar con ensayos de turbidez y de coágulos de gel
Agua de grado LAL	Asociados de Cape Cod	WP0501	Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato LAL
Tampón Glucashield	Asociados de Cape Cod	GB051-25	Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mm	Asociados de Cape Cod	TB240	Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 8 x 75 mm	Asociados de Cape Cod	TK100	Estos tubos se pueden utilizar con ensayos de turbidez y cromogénicos
Puntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1,0 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Las puntas y pipetas pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se ha verificado y confirmado su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga sin pirógenos, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas con tasa de pirógeno, 5 ml	Eppendorf	30089669	Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repetición	Eppendorf	4982000020	Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
Refrigerador, 2-8 C	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
vórtice	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
Congelador, -20 C	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
Lector Pyros Kinetix o Pyros Kinetix Flex	Asociados de Cape Cod	PKF96	Se pueden utilizar otros instrumentos. Sin embargo, los reactivos de LAL y los estándares de endotoxinas utilizados en este ensayo pueden requerir optimización. Cuando se utilice otro instrumento, consulte los fabricantes del instrumento y del kit LAL para obtener instrucciones