Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus con coágulo de gel: un método para la detección de endotoxinas bacterianas en formulaciones de nanopartículas

Resumen

Fuente: Neun, B. W. et al., Detección de endotoxinas en nanoformulaciones mediante ensayos de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe un ensayo de coágulos de gel para determinar la presencia de endotoxinas bacterianas en nanoformulaciones utilizando el lisado de amebocitos de Limulus derivado de las células sanguíneas de cangrejos herradura. El ensayo ayuda a analizar la contaminación por endotoxinas de los productos farmacéuticos, incluidas las formulaciones basadas en nanotoxinas.

Protocolo

1. Preparación de muestras de nanopartículas

1. Prepare la muestra de estudio en agua de grado LAL.
2. Si el pH de la muestra está fuera del rango 6-8, ajuste el pH utilizando hidróxido de sodio sin pirógenos o ácido clorhídrico.
3. Con agua de grado LAL, prepare varias diluciones de la muestra de estudio. Asegúrese de que la dilución más alta no exceda la dilución máxima válida (MVD).

2. Preparación de reactivos comunes entre formatos LAL

1. Diluir el caldo concentrado de hidróxido de sodio utilizando agua reactiva LAL sin pirógenos para preparar una solución de trabajo a una concentración de 0,1 N.
2. Diluir el caldo concentrado de ácido clorhídrico con agua reactiva de LAL sin pirógenos y preparar una solución de trabajo a una concentración final de 0,1 N.
3. Preparación de la endotoxina estándar de control (CSE)
   1. Reconstituya el CSE de acuerdo con el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      nota: Consulte la Tabla de Materiales para obtener detalles sobre el número de catálogo y la aplicación de una formulación de CSE determinada en diferentes formatos de LAL.
4. Preparación del reactivo LAL
   1. Reconstituya el reactivo LAL de acuerdo con el certificado de análisis proporcionado por el fabricante.
      nota: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el número de catálogo y la aplicación de una formulación de reactivo de LAL determinada en diferentes formatos de LAL.

3. Gel-Clot LAL

NOTA: Este ensayo identifica la presencia de endotoxinas en la muestra basándose en la observación visual y la detección de un coágulo en el tubo de reacción. Los pasos experimentales se describen a continuación. Utilice una hoja de banco para registrar los resultados. Esta hoja de banco no es obligatoria, y también se aceptan otras formas de registrar los resultados del ensayo. Un ejemplo de este tipo de hoja de banco se proporciona en materiales complementarios para la comodidad del lector. Lambda (l) es la sensibilidad del ensayo de coágulo de gel y es de 0,03 UE/mL.

1. Etiquete tantos tubos de reacción como sea necesario para acomodar el número de muestras de prueba analizadas. Consulte la hoja de laboratorio para obtener detalles sobre el número de réplicas utilizadas en los pasos 1, 2 y 3 del ensayo.
2. Alícuota 100 μL de agua, controles o muestra de prueba por tubo.
3. Prepare el CSE de tal manera que la concentración final sea igual a 4λ.
4. Combine 100 μL del estándar mencionado anteriormente con 100 μL de agua o muestra de prueba para lograr la concentración final de CSE de 2λ. Repita tres veces más para lograr lambda y media lambda y un cuarto de lambda.
5. Asegúrese de que la temperatura en el baño de agua sea de 37 °C.
6. Añadir 100 μL de lisado por tubo de ensayo, vórtice brevemente, y colocar la rejilla con todos los tubos en el baño de agua durante 1 h.
7. Invierta el tubo con un movimiento suave.
8. Registre manualmente los resultados usando "+" (coágulo firme) o "-" (sin coágulo o coágulo suelto) en la hoja del banco.
9. Proceda con el análisis de acuerdo con la USP BET 85; utilice la hoja de banco como material de soporte.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo LAL	Asociados de Cape Cod	G5003	Este reactivo es específico para el ensayo de coágulos de gel
Norma de control de endotoxinas	Asociados de Cape Cod	E0005	Este reactivo se puede utilizar con ensayos de turbidez y coágulos de gel
hidróxido sódico	sigma	S2770	Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6 y 8
ácido clorhídrico	sigma	H9892	Cuando es necesario, se utiliza para ajustar el pH de la muestra para que esté entre 6 y 8
Agua de grado LAL	Asociados de Cape Cod	WP0501	Este reactivo se puede utilizar con cualquier formato LAL
Tampón Glucashield	Asociados de Cape Cod	GB051-25	Se utiliza para prevenir la respuesta falsa positiva de los betaglucanos
Tubos de dilución de vidrio desechables sin endotoxinas 12 x 75 mm	Asociados de Cape Cod	TB240	Estos tubos se pueden utilizar con los tres ensayos
Tubos de reacción de vidrio desechables sin endotoxinas 10 x 75 mm	Asociados de Cape Cod	TS050	Estos tubos son para usar con el ensayo de coágulo de gel
Puntas sin pirógenos con volúmenes de 0,25 y 1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Las puntas y pipetas pueden adsorber endotoxinas y liberar lixiviables que interfieren con el ensayo de LAL. Estas puntas RAININ se utilizan porque se ha verificado y confirmado su rendimiento óptimo en el ensayo LAL
Tubos de microcentrífuga sin pirógenos, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Boquillas combinadas con tasa de pirógeno, 5 ml	Eppendorf	30089669	Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Pipeta de repetición	Eppendorf	4982000020	Se pueden utilizar otros suministros equivalentes
Microcetrífugo	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
Refrigerador, 2-8° C	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
vórtice	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
Congelador, -20 C	Cualquier marca		Se puede utilizar cualquier marca
Baño de agua, 37° C	Cualquier marca		Se puede usar cualquier marca, sin embargo, es importante apagar la circulación de agua o usar un baño de agua no circulante porque el flujo de agua afectará la formación de coágulos y dará lugar a resultados falsos negativos