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1. Activación de la placa del kit de ensayo
- Active la placa del kit de ensayo del filtro de 96 pocillos (que contiene CPH-xilan azul) (Lista de materiales) añadiendo 200 μl de solución de activación (obtenida con el kit) en cada pocillo, seguido de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente sin agitación.
- Aplique vacío usando un colector de vacío (con el bloque espaciador adentro y cualquier placa estándar transparente de 96 pocillos como placa de recolección) para eliminar la solución de activación existente. También es posible utilizar una centrífuga a 2.700 x g durante 10 minutos para este paso en lugar del colector de vacío.
- Lave los sustratos de CPH agregando 100 μl de agua estéril y aplique un vacío (o fuerza centrífuga) para eliminar el estabilizador. Repita este paso dos veces más y las placas ya están listas para usar.
2. Reacción enzimática
NOTA: Incluya siempre el tampón solo como control negativo y, si es posible, las enzimas previamente caracterizadas como controles positivos. Utilice un número estadísticamente adecuado de réplicas. Los sustratos de CPH son estables entre pH 3.0 y 10.0 y el volumen total de la solución enzimática del extremo tampón en cada pocillo no debe exceder los 180 μl. También se puede usar extracto de plantas o caldo de cultivo en lugar de una solución enzimática purificada.
- Añadir 150 μl de tampón de acetato de sodio 100 mM, pH 4,5 y 5 μl de solución de endocelulasa (hasta una concentración final de 1 U/ml) a cada pocillo de la placa del kit de ensayo.
- Coloque la placa del producto (una placa de pocillo transparente compatible con el lector de placas de microtitulación) debajo de la placa del kit de ensayo para recoger cualquier posible fuga de la placa de reacción durante la agitación.
- Incubar la placa del kit de ensayo a 25 °C durante 30 min en un agitador horizontal a 150 rpm.
NOTA: La mezcla de la reacción en la placa del kit de ensayo durante la incubación es crucial para lograr un resultado consistente y reproducible. Los sustratos CPH son estables hasta 90 °C. El tiempo de incubación debe aumentarse hasta 24 horas cuando se analizan caldos de cultivo que contienen concentraciones de enzimas desconocidas con sustratos de CPH. Tenga en cuenta que los tiempos de incubación apropiados dependen de la actividad de la(s) enzima(s), pero en general, si no hay actividad detectable dentro de las 24 horas, es probable que la enzima no degrade el sustrato analizado. Una enzima activa degrada los polisacáridos cromogénicos insolubles del sustrato CPH en oligosacáridos cromogénicos solubles, que son visibles como sobrenadante coloreado.
- Coloque la placa de producto limpia dentro del colector de vacío con el bloque espaciador adentro.
- Coloque la placa del kit de ensayo en la parte superior y aplique un vacío (presión negativa máxima de -60 kPa). También es posible utilizar una centrífuga a 2.700 x g durante 10 min.
NOTA: El filtrado que contiene los oligosacáridos coloreados como producto de reacción se encuentra ahora en la placa del producto para su posterior análisis.
3. Detección y cuantificación
- Verifique que el volumen de líquido en cada pocillo de la placa del producto sea aproximadamente el mismo mediante inspección visual.
- Lea la absorbancia de la placa colectora a 595 nm para el CPH-xilano azul utilizando un lector de placas.
- Al realizar el análisis de datos, reste los valores de control negativo solo del tampón de los valores de los pocillos donde se agregó una enzima. Calcule el valor medio y el error estándar de medias (SEM) de los pozos replicados.