1. Ensayo cromogénico con sustratos ICB en un formato de 96 pocillos
- Reacción enzimática
- Añadir 150 μl 100 mM de tampón de acetato de sodio, pH 4,5 y 5 μl 31 U/ml de solución de endoxilanasa a cada pocillo de la placa del kit de ensayo que contiene paja de trigo ICB roja (concentración final de enzima en el pocillo: 1 U/ml).
nota: Las placas del kit de ensayo (placas de filtro de 96 pocillos que contienen sustratos ICB) se fabrican como se describe en la literatura (consulte la Lista de materiales). Los sustratos ICB son estables en tampones con un rango de pH entre pH 3.0 y 10.0. Incluya siempre el tampón solo como control negativo, las enzimas comerciales como control positivo y utilice un número estadísticamente adecuado de réplicas.
- No active los sustratos ICB como la placa de sustrato CPH, sino que retire el estabilizador lavando tres veces con 100 μl de agua seguido de filtración al vacío o centrifugación.
- Coloque la placa de producto debajo de la placa de sustrato para recoger cualquier posible fuga de la placa de sustrato durante el agitado.
- Incubar la reacción a 25 °C agitando a 150 rpm durante 2 hr.
nota: Una enzima activa está degradando los polisacáridos cromogénicos insolubles en el sustrato de ICB en oligosacáridos solubles, que son visibles como sobrenadante coloreado. Los sustratos ICB son estables hasta 90 °C. El tiempo de incubación debe aumentarse hasta 24 horas si se utilizan enzimas no purificadas, como caldos de cultivo.
- Coloque la placa del producto dentro del colector de vacío con el bloque espaciador dentro.
- Coloque la placa del kit de ensayo en la parte superior y aplique vacío (presión negativa máxima de -60 kPa) o use una centrífuga para filtrar el producto de la placa del kit de ensayo al pocillo de la placa del producto.
nota: El filtrado que contiene los oligosacáridos coloreados como producto de reacción se encuentra ahora en la placa de recogida para su posterior análisis.
>2. Detección y cuantificación
- Verifique que el volumen de líquido en cada pocillo de la placa de recolección sea aproximadamente el mismo mediante inspección visual.
- Lea la absorbancia de la placa colectora a 517 nm para paja de trigo roja ICB usando un lector de placas.
- Al realizar el análisis de datos, reste el tampón, solo los valores de control negativos de los valores de los pozos donde se agregó una enzima. Calcule el valor medio y el error estándar de medias (SEM) a partir de los pozos replicados.
nota: En caso de cribado de enzimas desconocidas, sugerimos realizar una serie de diluciones para obtener datos más detallados sobre el rango dinámico de la actividad de la enzima.
