1. Ensayo de citotoxicidad: Configuración
- Prepare soluciones de compuestos de interés en las concentraciones deseadas en los medios apropiados (sin suero o 1, 2.5 o 5% FBS RPMI-1640).
- Para medir la citotoxicidad de un solo compuesto (por ejemplo, para determinar dosis efectivas), prepare compuestos a una concentración final 2x.
- Para medir la citotoxicidad de las combinaciones de compuestos, prepare los compuestos a una concentración final 4x.
- Prepare controles de solo solvente mezclando la misma cantidad de solvente con el medio apropiado. Por ejemplo, si se prueban compuestos disueltos en DMSO y metanol, realice un control de solo solvente para cada solvente.
- Recoja las células de la placa de cultivo o matraz en un tubo cónico de 15 ml.
- Transfiera 10 μL de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga y tiña con 10 μL de azul de tripán al 0,4%. Use un hemocitómetro para contar las células viables y no viables para cada fuente celular.
- Pellets a 200 g durante 5 min. Aspirar o decantar sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo de celda en un medio apropiado para el ensayo (sin suero o 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640) a una densidad celular de 3 * 105 celdas/mL.
NOTA 1: La densidad de celdas de 3 * 105 celdas / mL proporciona una densidad de siembra de 15,000 celdas / pocillo. La densidad de siembra es un parámetro importante e idealmente debería estar predefinida antes del experimento. La densidad de siembra debe tener en cuenta: 1) el tamaño de la célula: por lo general, las celdas más grandes se siembran con una densidad más baja; 2) duración del tratamiento: las células generalmente se siembran a una densidad más baja para experimentos que durarán más tiempo, y 3) tasa de división celular: las células con una tasa de división más alta se siembran a una densidad más baja. Ejemplos específicos de densidades de siembra optimizadas: celdas K562, más grandes, duración de 24 h: 10.000 celdas/pocillo; Células MOLM-13, tamaño moderado, tratamiento de 24 horas: 15.000/pocillo; Celdas MOLM-13, tratamiento de 48 h – 8.000/pocillo; pequeñas células mononucleares de sangre periférica (PBMC) sanas, tratamiento de 24 horas: 50.000/pocillo; células primarias de LMA, tratamiento de 24 horas: 15.000-20.000/pocillo.
NOTA 2: La presencia de FBS en los medios puede afectar la actividad de los compuestos. La reducción de la concentración de FBS puede hacer que los resultados del ensayo sean más fáciles de interpretar, pero también reduce la precisión fisiológica.
- Siembre 50 μL de suspensión celular del paso 1.5 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal.
- Agregue compuestos de la siguiente manera:
- Para ensayos de un solo compuesto, agregue 50 μL de solución compuesta 2x en cada pocillo. Para pozos de control de solventes, agregue 50 μL de medio de prueba que contenga el solvente a la concentración 2x.
- Para ensayos combinados, agregue 25 μL de cada uno de los compuestos (4 soluciones) en cada pocillo. Para pocillos de control de un solo compuesto, agregue 25 μL de solución compuesta 4x y 25 μL de medio de prueba. En el caso de los pocillos de control de disolventes, añada 50 μL de medio de ensayo o de medio de ensayo que contenga el disolvente.
NOTA 1: La concentración final de DMSO no debe exceder el 0,5%.
NOTA 2: Se recomienda añadir el medio que contiene los compuestos con la pipeta tocando la pared de cada pocillo debido al bajo volumen.
- Golpee suavemente la placa para asegurar la mezcla del contenido de los pocillos.
- Incubar las placas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2 durante un tiempo adecuado, por ejemplo, 24 h.
2. Ensayo de citotoxicidad: tinción con Hoechst 33342 y yoduro de propidio
- Prepare 10 veces la solución de tinción. Esta solución debe prepararse fresca antes de cada experimento, no se puede almacenar. Las concentraciones finales de colorante deben determinarse antes del experimento.
- Para las líneas celulares de leucemia y las células de leucemia primaria, 1 mL de tampón de tinción 10x contiene 10 μL de Hoechst 33342 de 20 mM y 50 μL de yoduro de propidio de 1 mg/mL en PBS estéril (concentraciones finales: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- En el caso de las PBMC sanas, 1 ml de tampón de tinción 10x contiene 10 μl de Hoechst 33342 de 20 mM y 10 μl de yoduro de propidio de 1 mg/ml en PBS estéril (concentraciones finales: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL)
nota: La concentración final de yoduro de propidio debe determinarse antes de los experimentos. Las células deben probarse utilizando un rango de concentraciones de PI (1, 2,5, 5 μg/mL) y, a continuación, la viabilidad calculada por Hoechst/PI debe compararse con la viabilidad medida mediante azul de tripán. Las concentraciones de PI enumeradas anteriormente se eligieron en función de la viabilidad de la célula diana en los pozos de control de medios (por encima de ~90% para las líneas celulares de leucemia, por encima de ~70% para las PBMC sanas)
cautela: El Hoechst 33342 y el yoduro de propidio son carcinógenos potenciales. Use el equipo de protección personal adecuado cuando los manipule.
- Después de la incubación, utilice una pipeta multicanal para añadir 10 μL de tampón de tinción 10x a cada pocillo.
nota: Para evitar la contaminación cruzada, asegúrese de que las puntas de las pipetas no toquen el medio.
- Golpee suavemente el plato para mezclar y eliminar las burbujas. Manchar a 37 °C durante 15 min.
- Centrifugar la placa a 200 g durante 4 minutos para llevar todas las células al fondo de la placa. Limpie cuidadosamente la parte inferior de la placa con una toallita húmeda para eliminar las fibras y/o los residuos que interfieran con la imagen.
NOTA 1: La centrifugación de la placa garantiza las mayores posibilidades de que todas las células se capturen en la imagen. A menudo, las células muertas se desprenden y flotan, proporcionando valores engañosos de citotoxicidad. La centrifugación mitiga este efecto.
NOTA 2: La placa debe ser fotografiada lo más rápido posible después de la centrifugación, idealmente, dentro de los 15 minutos. La centrifugación puede reducir la selectividad de la tinción de PI y puede permitir que las células acumulen lentamente yoduro de propidio. La mejora en la precisión obtenida mediante la visualización de las células muertas supera el ligero aumento en la tinción de PI
