Ensayo de tinción nuclear diferencial: un ensayo para determinar la citotoxicidad del mitocan mediante yoduro de propidio y doble tinción de Hoechst

Resumen

Fuente: Pei, J. et al., Un ensayo de tinción nuclear diferencial automatizado para la determinación precisa de la citotoxicidad mitocánica. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra un método de tinción nuclear para detectar el efecto citotóxico de mitocan en células cancerosas sensibles a medicamentos y variantes sanas. La doble tinción con colorantes de unión al ADN, como el yoduro de propidio y el colorante de Hoechst, proporciona una distinción clara entre las células muertas y las vivas, lo que ayuda a evaluar la citotoxicidad del fármaco.

Protocolo

1. Ensayo de citotoxicidad: Configuración

1. Prepare soluciones de compuestos de interés en las concentraciones deseadas en los medios apropiados (sin suero o 1, 2.5 o 5% FBS RPMI-1640).
   1. Para medir la citotoxicidad de un solo compuesto (por ejemplo, para determinar dosis efectivas), prepare compuestos a una concentración final 2x.
   2. Para medir la citotoxicidad de las combinaciones de compuestos, prepare los compuestos a una concentración final 4x.
   3. Prepare controles de solo solvente mezclando la misma cantidad de solvente con el medio apropiado. Por ejemplo, si se prueban compuestos disueltos en DMSO y metanol, realice un contro....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-desoxi-D-glucosa/2-DG	Químico-Impex	50-519-067
3-bromo-piruvato	Alfa Aesar	1113-59-3
Placas de 96 pocillos	Greiner Bio-One	655090	Placas de 96 pocillos de fondo plano negro o transparente
Contador de células automatizado Countess II	Termo Fisher
Lector multimodo de imágenes de 5 células Cytation	BioTek
Hoechst 33342	Termo Fisher	62249	Solución de 20 mM; concentración final 1:1.000
Suero fetal bovino HyClone	GE Cuidado de la Salud	#25-514
m-clorofenilhidrazona/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
Tabletas PBS	Termo Fisher	BP2944100	1 comprimido + 200 mL de agua estéril = 1x solución de PBS
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X)	Gibco	10378016
Yoduro de propidio	Termo Fisher	50-596-072	Polvo seco; stock 1 mg/mL en PBS; concentración final 5 μg/mL (células leucémicas), 1 μg/mL (PBMC normales)
rotenona	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 Medio con L-glutamina y bicarbonato de sodio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular	Sigma Aldrich	R8758-500ML
Tinción azul de tripán (0.4%)	Gibco	15250-061
Líneas celulares
K562	ATCC	CCL-243	Línea celular de LMC
MOLM-13	ATCC		Línea celular de LMA
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	TODAS las líneas celulares
OCI-AML2	ATCC		Línea celular de LMA